研究背景 組織器官的缺血性損傷嚴重威脅人類的生命健康，其生存率低、預后差，成為臨床治療的一個難題。然而，傳統(tǒng)的治療方法難以從根本上恢復血管內皮細胞的數(shù)量和功能，改善組織器官的血流灌注。再生醫(yī)學近二十年的發(fā)展涉及到生物學、材料學、工程學和臨床醫(yī)學等多學科，它為治療缺血性疾病提供了新的治療方法。尤其干細胞的研究，近十年取得的突破性進展為再生醫(yī)學的發(fā)展帶來了新的機遇。將間充質干細胞應用于再生醫(yī)學領域治療各種缺血性疾病，正發(fā)揮著巨大的應用潛力。目前，對于間充質干細胞的應用，主要以各種手段將其誘導分化為內皮細胞，而誘導方法主要是通過干/祖細胞的基因修飾、藥物作用以及細胞因子的聯(lián)合運用等手段，盡管這些方法均可以成功實現(xiàn)誘導，但是他們所引起的過度分化問題引起了研究者的關注。對于具有無限分化潛能的間充質干細胞而言，是否能通過改變細胞自身的某些性質，達到提高干細胞誘導效率的目的。但是，目前尚無此類方法的報道。 隨著航天事業(yè)的發(fā)展，人們在空間科學領域的研究取得了一些創(chuàng)新成果，尤其在空間環(huán)境的微重力作用下，細胞的增殖凋亡和人體各系統(tǒng)功能均呈現(xiàn)了一定的改變。研究證明，微重力作用下細胞形態(tài)和功能改變與其所處的細胞內環(huán)境息息相關。而我們的研究發(fā)現(xiàn)，微重力刺激后BMSCs的形態(tài)由“長梭形”轉變?yōu)椤邦悎A形”，這種形態(tài)的改變具有什么意義呢？中醫(yī)學的“形神觀”闡明了人的形質及由形質構成的形體與生命機能活動的密切聯(lián)系。形者神之質，神者形之用，形態(tài)的變化與其功能的改變是統(tǒng)一的，必然會伴隨產生一系列生理或病理變化。微重力刺激后的BMSCs形態(tài)的圓形改變，可能是一種原始狀態(tài)的回歸，這種回歸將形態(tài)結構有序與功能有序相統(tǒng)一，使干細胞處于形神相即的平衡環(huán)境中。在這種環(huán)境中，BMSCs自身是否具備了更強的分化潛能呢？其向內皮細胞的分化能力又會發(fā)生什么樣的變化呢？微重力刺激后，細胞形態(tài)所呈現(xiàn)的變化影響細胞分化功能的調節(jié)機制又是什么呢？據此，我們進行了以下實驗研究。 目的： 1.研究BMSCs體外的培養(yǎng)、鑒定和標記方法。 2.觀察體外條件下模擬微重力刺激對BMSCs向內皮細胞分化的作用。 3.觀察模擬微重力刺激后的BMSCs移植對小鼠缺血下肢血管新生的作用。 4.通過觀察模擬微重力刺激后細胞形態(tài)的變化對細胞骨架的影響，探討骨架蛋白相關分子RhoA在BMSCs向內皮細胞分化中的作用。 5.從現(xiàn)代醫(yī)學角度解釋中醫(yī)理論，尋求細胞形態(tài)和功能統(tǒng)一性與中醫(yī)學“形神觀”的契合點。 方法： 1.采用全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)大鼠BMSCs，觀察細胞形態(tài)；采用MTT法檢測BMSCs的生長和存活能力；應用流式細胞術鑒定細胞表面標志性抗原CD29、CD34、CD45、CD90的表達；并將BMSCs分別用成脂和成骨培養(yǎng)基定向誘導，采用油紅O和茜素紅染色鑒定分化后的細胞；凍存和復蘇BMSCs后，觀察其存活率和生長狀態(tài)；應用DiI標記BMSCs，觀察其標記效果和對BMSCs生長狀態(tài)的影響。 2.將第3代BMSCs隨機分為空白對照組（control組）、正常重力培養(yǎng)組（NG組）、2D-clinostat刺激培養(yǎng)組（MMG組）；在微重力和正常重力刺激72h后，將細胞加入內皮細胞的誘導培養(yǎng)液誘導6天，運用倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)，分別運用免疫熒光、流式細胞檢測、Real-time PCR、Western blot觀察誘導后內皮樣細胞Flk-1、vWF的表達；ELISA法檢測血管內皮生長因子、堿性成纖維生長因子濃度；采用脂質吞噬實驗和基質膠血管形成實驗檢測正常重力和微重力刺激后BMSCs誘導分化的內皮細胞的功能。 3.制備小鼠股動脈結扎下肢缺血模型，將BMSCs分別進行微重力和正常重力刺激72h后應用DiI標記，于股動脈結扎術后1天進行干細胞移植。分別于術后第1d、第21d，使用激光多普勒灌注成像儀檢測患肢血流灌注恢復情況。術后21天，處死小鼠。免疫組化HE染色檢查組織損傷和修復情況；流式細胞儀檢測缺血肌肉中所含DiI陽性細胞數(shù)；免疫熒光雙染及Western blot檢測血管內皮細胞轉化效率及vWF的表達量。 4.將第3代BMSCs隨機分為正常重力組（0h組），微重力4h組（4h組）、微重力72h組（72h組）和微重力10d組（10d組）。采用倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)的變化；流式細胞儀檢測細胞凋亡；免疫熒光法檢測細胞骨架F-actin的變化。最后，免疫熒光法確定BMSCs中RhoA的定位，并構建RhoA的質粒轉染載體，驗證其轉染效率；將轉染成功后的BMSCs進行微重力72h刺激，并進行內皮細胞的誘導，探討RhoA的活化和抑制對BMSCs誘導的內皮細胞標志物Flk-1、vWF的表達、管腔形成的影響。 結果： 1.通過全骨髓貼壁方法培養(yǎng)的BMSCs貼壁生長，原代培養(yǎng)9～12d可傳代，傳代后增殖速度增快，P3代細胞已基本純化。P3代BMSCs呈紡錘形或長梭形，漩渦狀排列。經流式細胞儀鑒定，表達CD29、CD90陽性，表達CD34、CD45陰性，符合BMSCs的特征；其能夠被誘導分化為脂肪細胞和成骨細胞；經凍存和復蘇后的BMSCs生存率高，達90%和85%，且生長狀態(tài)良好；應用DiI標記BMSCs的有效率為100%，標記72h后觀察發(fā)現(xiàn)其熒光顯色強度無明顯變化，且對BMSCs的生長狀態(tài)無影響。 2.微重力刺激72h后，加入內皮細胞誘導培養(yǎng)液誘導的BMSCs，可觀察到內皮細胞標志物Flk-1和vWF在免疫熒光檢測、流式細胞檢測、mRNA及蛋白水平的表達明顯高于正常重力組。DiI-Ac-LDL吞噬實驗、體外血管成形實驗的陽性結果也提示誘導后的細胞具備了內皮細胞的功能。 3.對制備下肢缺血模型的小鼠進行微重力刺激后的BMSCs移植，在造模后第21天，與其它組比較，小鼠缺血后肢激光多普勒血流灌注圖像指數(shù)（LDPI index）改善最為明顯。免疫組化HE染色顯示微重力組細胞移植對缺血肢體的萎縮和肌肉的壞死損傷顯示出明顯的保護作用；流式細胞術檢測DiI陽性細胞數(shù)和免疫熒光雙染顯示，微重力組移植的BMSCs在體內存活、分化為血管內皮細胞的數(shù)目顯著高于正常重力組；缺血下肢中vWF在蛋白水平表達增加。 4.微重力刺激0h、4h、72h和10d后，BMSCs形態(tài)由梭形向類圓形轉變；流式細胞儀檢測各時間段細胞凋亡情況無明顯差異；免疫熒光檢測細胞骨架變化發(fā)現(xiàn)，微重力刺激72h時變化最明顯，微絲表達明顯下降，張力降低。而對于RhoA的表達發(fā)現(xiàn)其在BMSCs中主要分布于胞漿和胞膜上；通過構建質粒轉染的方式，驗證了活化的RhoA可以促進內皮細胞標志物Flk-1和vWF的表達、管腔的形成，而沉默的RhoA則使BMSCs上述生物學行為受到抑制。 結論： 1.本實驗采用全骨髓貼壁法成功培養(yǎng)了大鼠BMSCs，并對其進行了分離、純化和擴增，還對其生物學特性和DiI標記進行了初步研究。 2.微重力刺激后的BMSCs在體外向內皮細胞的分化能力增強。 3.微重力刺激后的BMSCs移植具有更強的向內皮細胞分化和促進血管新生的能力。 4.在微重力刺激72h時，細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，RhoA可能通過調控細胞骨架解聚，從而促進其誘導分化為內皮細胞和血管形成。 5.在中醫(yī)學“形神觀”中“形神合一”觀點指導下，微重力刺激后的BMSCs形態(tài)的圓形改變使其處于特殊條件下的回歸狀態(tài)中，這種回歸為干細胞自身提供了一種圓融、平衡的更適合其分化的環(huán)境，從而提高了BMSCs向內皮細胞的分化能力。
【學位單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2013
【中圖分類】：R329
【部分圖文】：

管新生中的研究現(xiàn)狀皮細胞誘導分化的研究壁由內膜、中膜和外膜三層組成。內膜位于管壁的層兩層結構。內皮細胞襯附于血管內，以其光滑的層為薄層的結締組織，具有維持血管壁收縮的作用性纖維兩層結構，具有回縮擴張血管、維持張力作有修復能力。內皮細胞在血管生成過程中主要通過樣結構[19;20]，從而完成促進血管新生的作用(圖 1)十分有限。因此，為了產生血管樣結構需要細胞不的內皮細胞成為擺在研究者面前的一道難題。大家試圖通過干細胞的分化解決此問題。BMSCs 易于內皮細胞，日益成為促進血管新生中理想的種子細

A（×100） B（×100）圖 1-1 BMSCs 細胞形態(tài)圖A 圖為 P0代 BMSCs，可見細胞形態(tài)各異，B 圖為 P3代 BMSCs，可見細胞形態(tài)均一，成旋渦狀分布。4.2 BMSCs 的生長曲線BMSCs 在傳代后增殖速度較原代明顯增快，一般在 7d 左右融合就可達到 8以上。細胞整體生長曲線呈 S 形：以 P3代細胞為例（圖 1-2），傳代后 1～2d 為伏期，3～6d 處于對數(shù)生長期，7～9d 進入平臺期。

A（×100） B（×100）圖 1-1 BMSCs 細胞形態(tài)圖A 圖為 P0代 BMSCs，可見細胞形態(tài)各異，B 圖為 P3代 BMSC可見細胞形態(tài)均一，成旋渦狀分布。Cs 的生長曲線Cs 在傳代后增殖速度較原代明顯增快，一般在 7d 左右融合就可胞整體生長曲線呈 S 形：以 P3代細胞為例（圖 1-2），傳代后 16d 處于對數(shù)生長期，7～9d 進入平臺期。

【參考文獻】

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本文編號：2821645