【摘要】：骨缺損(bone defect)、尤其是長段骨缺損一直是骨科界的難題之一。迄今為止臨床上對因創(chuàng)傷、感染和腫瘤切除后所造成的長段骨缺損的修復仍未得到有效的解決。傳統(tǒng)的移植方式主要有自體骨移植和異體骨移植，但自體骨移植面臨著骨源受限、增加創(chuàng)傷和感染率等缺陷，而異體骨移植存在生物活性差、免疫排斥反應和傳播疾病的危險。上世紀九十年代開始，研究者將更多的注意力放在了組織工程骨的開發(fā)和研究上。其基本方法是將體外培養(yǎng)的種子細胞種植在具有生物相容性和可降解性的天然或者人工合成的細胞外基質上，然后將此細胞．支架材料復合物植到體內，以誘發(fā)所希望的細胞響應(粘附、分化和增殖等)。目前，骨組織工程的研究主要集中于種子細胞的研究、支架材料的研制和組織工程化人工骨對骨缺損的修復。 骨髓間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一種具有自我更新和復制能力的成體干細胞，具有明確的成骨分化潛能，易于獲得及擴增，其獨特的細胞增殖分裂模式使外源基因易于導入和表達，因此成為目前研究最廣泛的組織工程骨種子細胞。與骨膜源成骨細胞等其它種子細胞相比，MSCs具有取材方便、對供體部位損傷小等優(yōu)點，臨床應用前景更廣闊。MSCs在條件培養(yǎng)基的誘導下可以體外分化為成骨細胞，盡管已有實驗證實，多種生長因子如骨形成蛋白2(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)、成骨因子1(osteogenic protein-1，OP-1)等能促進MSCs的成骨分化，然而如何使MSCs進行定向誘導成骨分化，從而更好的應用于骨組織工程是我們亟待解決的問題。 Cbfal是成骨細胞特異性轉錄因子，成體中僅在成骨細胞和骨組織表達；胚胎發(fā)育過程中，Cbfal在間充質細胞凝聚區(qū)高表達。基因敲除鼠證明Cbfal對成骨細胞分化和骨形成具有重要作用。利用Cbfal對MSCs進行基因修飾，是否可以達到定向成骨誘導分化的效應?本實驗圍繞這一中心展開研究。 本實驗在成功構建Cbfal重組腺病毒和分離培養(yǎng)純化MSCs的基礎上，檢測了Cbfal對MSCs的成骨定向分化作用，并利用改良設計的流動腔灌流裝置，對Cbfal基因修飾MSCs與脫細胞骨基質復合后動態(tài)培養(yǎng)，觀察了所構建的組織工程化骨對兔橈骨大段骨缺損的修復效應，并對其機理進行了初步探討，其主要結果如下： 第三軍醫(yī)大學博士學位論文 1.首先利用基因同源重組原理，通過pAdEasy腺病毒系統(tǒng)構建了Cbfal重組腺病 毒，以及對照病毒pAdEasy一GFP一gal。并通過GFP熒光表達、PCR等方法證明目的基 因存在于所構建載體中。病毒純化后病毒滴度達1.6x 10’2，NIH3T3細胞感染實驗顯 示，Cbfal腺病毒能有效的介導Cbfal的表達。 2.利用Cbfal重組腺病毒轉染MSCs，經蛋白印跡、免疫組化、熒光觀察等證實 了Cbfal目的基因在MSCs中的表達。同時利用RT一PCR、對硝基苯磷酸二鈉法和放 免法檢測成骨細胞標志基因ALP、OCN、OPN、I型膠原表達及BMP一2、MyoD、PPAR YZ、OPG等基因表達，結果Cbfal可以提高除I型膠原外大部分成骨細胞標志基因 的表達，ALP活性和OCN含量明顯提高，而成脂、成肌方向分化明顯抑制，骨礦化 小結計數(shù)明顯增多，表明Cbfal基因修飾可以促進MSCs的成骨定向分化。 3.對云南版納小型豬近交系的骨組織進行脫細胞處理，獲得脫細胞骨基質材料， 經組織學染色、SEM觀察、異種抗原檢測和生物力學檢測表明該基質材料在去除細胞 成分的基礎上，消除了抗原性，保留骨細胞外基質的生理結構，為種子細胞的種植提 供了良好的空間結構和生長環(huán)境。細胞種植在該材料上后，細胞的增殖和生長不受抑 制，可以正常的粘附、伸展及分化。因此本實驗制備的脫細胞骨基質具有良好的細胞相 容性、骨誘導性和力學特性，是一種較理想的支架材料。 4.改良設計一種新型的流動腔灌流體系，實現(xiàn)種子細胞的動態(tài)種植和體外培養(yǎng)。 檢測培養(yǎng)7d后ALP活性和OCN含量，顯示流動腔組明顯高于靜態(tài)培養(yǎng)組，而Cbfal 組明顯高于對應的對照組。表明Cbfal作為流體力學刺激的靶基因，進一步促進了 MSCs的定向分化:也證明了我們改良設計的流動腔灌流裝置是一種簡便易控、有效 的生物反應器。 5.建立兔撓骨1.2cm骨缺損，分別以材料一Cbfal基因修飾細胞、材料一未修飾細胞、 單純材料和不作處理的空白對照進行修復實驗，在4w、sw、12w進行X線檢查和組織 學觀察。結果表明空白組骨不連，單純材料組有少量新骨生成，材料一未修飾細胞組有較 多新骨生成，材料一基因修飾細胞組在12w得到了臨床治愈。 總之，本實驗成功地構建了Cbfal重組腺病毒，并利用其轉染MSCs，使MSCs 在Cbfal的調控下成骨定向分化;制備了版納小型豬的脫細胞骨基質，以此為支架材 料，對Cbfal基因修飾的MSCs進行動態(tài)培養(yǎng)，明顯促進了細胞的成骨分化;并觀察 了所構建的組織工程化骨對骨缺損的修復作用，旨在為骨缺損的治療提供新的思路， 為干細胞組織工程的研究奠定實驗基礎。
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2004
【分類號】：R329

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