發(fā)布時間：2020-07-31 14:01

【摘要】：噬菌體抗體庫技術為人抗體的制備提供了強有力的手段，是近年來抗體技術中的革命性進展。我們用經肝癌細胞體外免疫的淋巴細胞構建了表面表達Fab的人源性噬菌體抗體庫，并篩選出兩個特異性與肝癌細胞結合而不與正常肝細胞結合的Fab噬菌體克隆。 淋巴細胞的分離和體外培養(yǎng) 淋巴細胞來源于13例原發(fā)性肝癌病人外周血單個核細胞和一例肝癌病人的腫瘤引流區(qū)淋巴結。分離得到的淋巴細胞在體外進行培養(yǎng)，培養(yǎng)液中含有IL-2，PWM和LPS。肝癌細胞系SMMC-7721用細胞固定液固定或經。~(60)Co照射后，加入淋巴細胞培養(yǎng)液中，進行體外免疫。培養(yǎng)7天后出現胞體增大的淋巴母細胞并可見克隆性增生。 人Fab抗體庫的構建 從體外培養(yǎng)的淋巴細胞中提取總RNA，并用一套引物逆轉錄PCR擴增出7種Fd基因(γ)和9種全長輕鏈基因(6λ，3κ)。通過將輕鏈基因和重鏈Fd基因插入噬菌體表達載體pComb3并經輔助噬菌體VCSM13超感染，構建了人Fab組合抗體庫。用羊抗人IgG Fab和HRP-羊抗人IgG Fab進行夾心ELISA檢測，可以鑒定噬菌體表達Fab的情況。 抗體庫的篩選 將抗體庫與肝癌細胞系SMMC-7721孵育，結合的噬菌體用Ph2.2的洗脫緩沖液洗脫，并感染XL1-Blu進行增殖。為了提高肝癌特異性結合的噬菌體并降低無關噬菌體的結合，我們采用了競爭篩選方法。首先將抗體庫與肝癌細胞結合，然后稀釋到過量的正常肝細胞懸液中，
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：1999
【分類號】：R735.7;R392
【圖文】：

巾拳二壬二巴學忿毛立示侖用淋巴結來源的CDNA為模板，上述基因中有的沒Fd基因中，擴增出vHlf，vHZ一4f，vHla，VH3a;Fd基因用混合的上游引物擴增出弱陽性;基因中擴增出VLZ，VL3，VL4，VLS，VK抓。7依次為:VHlf，VHZ一4fM:f，(’RMa丈、ker(237，377VH3f，VH6f，VHla，VH:〕a，515，697，994，154:弓)

依次為:VHlf，VHZ一4f:f，(’RMa丈、ker(237，377VH3f，VH6f，VHla，VH:515，697，994，154:弓)圖3PC尺擴增人工g(1i輕鏈基因依次為:vLI，vLZ，vL3，vL4，vLS，vL6，M:Pc

圖8單個噬菌體克隆與肝癌細胞結合活性的EL工AS結果(F7和HI為PBS陰性對照)正常肝細胞結合ELIAS將上述陽性克隆中D0值較高的37個克隆，進行正常肝檢測，同時做肝癌細胞結合ELIAS作為平行對照。結果:肝癌細胞和正常肝細胞兩者都結合，只有6個克隆不合。這些克隆分別是:A6(32)，Bzo(69)，el(70)，eZ(CS(83)。圖9單個噬菌體克隆與肝癌細胞結合活性的ELIAS結果(DS一10為PBS陰性對照)

【引證文獻】

相關期刊論文 前1條

1 柳鵬程;喬涵;劉斐斐;劉畢勝;吳倩妮;張燕燕;單金玉;魏蓮花;馬興銘;;噬菌體作為模式生物在蛋白表達和病毒學方面的應用[J];中國微生態(tài)學雜志;2012年05期

本文編號：2776563