本文關(guān)鍵詞：斑馬魚M型丙酮酸激酶功能的初步研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：丙酮酸激酶(PK)是糖酵解過程中的最后一個關(guān)鍵限速酶,催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)產(chǎn)生一分子丙酮酸和一分子腺苷三磷酸(ATP)。在哺乳動物中,丙酮酸激酶分為PKLR和PKM兩種形式,PKM又根據(jù)剪接方式的不同分為PKMl和PKM2,分別包含外顯子9和外顯子10。PKM1主要表達于高耗能組織如心臟、骨髂肌和腦組織,PKM2則主要表達于胚胎組織和快速增殖的腫瘤細胞中。近年來研究表明PKM2不僅作為丙酮酸激酶參與糖酵解過程,而且還具有蛋白激酶的活性。PKM2現(xiàn)已成為熱門研究領(lǐng)域,科學家主要集中在研究PKM2在腫瘤細胞中的作用。研究發(fā)現(xiàn),PKM2參與腫瘤細胞的Warburg效應(yīng),使腫瘤細胞在氧氣存在的情況下也通過有氧糖酵解的方式進行代謝。PKM2主要以二聚體和四聚體兩種形式發(fā)揮作用,在正常細胞中,PKM2主要以四聚體形式存在,具有丙酮酸激酶的活性,而二聚體形式的PKM2主要存在于腫瘤細胞中,具有蛋白激酶的活性。近年來的研究已經(jīng)證實,PKM2在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要功能,其作用機理已經(jīng)被基本闡明,成為近年來腫瘤研究的熱點。研究表明,缺氧能上調(diào)腫瘤細胞PKM2的表達水平,并且也已證實PKM2是HIF-1α直接調(diào)控的靶基因。經(jīng)生物信息學分析,在PKM2的第一個內(nèi)含子上有一個缺氧反應(yīng)元件(HRE),可被缺氧誘導(dǎo)因子1(HIF-1α)識別,從而調(diào)節(jié)PKM2的轉(zhuǎn)錄激活。對PKM2的氨基酸序列進行分析發(fā)現(xiàn),其羧基端具有核定位信號Arg399/400,在缺氧條件下會進到細胞核中發(fā)揮作用。在核內(nèi),PKM2和HIF-1α相互作用,激活HIF-1α的轉(zhuǎn)錄活性,從而促進HIF-1α靶基因的轉(zhuǎn)錄,包括和糖酵解相關(guān)的葡萄糖轉(zhuǎn)運子以及乳酸脫氫酶A,PKM2作為HIF-1α的靶基因,其轉(zhuǎn)錄活性也會被調(diào)控,這樣就在PKM2和HIF-1α之間形成一個反饋調(diào)節(jié)。然而,盡管PKM2與HIF-1α能夠相互作用已經(jīng)毋庸置疑,但是這些研究都是在體外細胞中進行的,至今尚無體內(nèi)研究證明二者相互作用及體內(nèi)生物學功能,尤其PKM2是否在早期胚胎發(fā)育中發(fā)揮作用,其是否參與了HIF在胚胎發(fā)育中的作用還是空白�，F(xiàn)在的觀點認為,腫瘤是發(fā)育生物學問題。PKM2既然對腫瘤至關(guān)重要,推測其在胚胎發(fā)育中極有可能發(fā)揮重要作用。而斑馬魚作為新型模式動物,在發(fā)育生物學的應(yīng)用相當廣泛。斑馬魚基因數(shù)據(jù)庫分析顯示,在斑馬魚存在兩個pkm基因,命名為pkma和pkmb,分別位于斑馬魚18號、25號染色體。結(jié)構(gòu)分析表明,其與哺乳動物高度保守。其中,斑馬魚中pkma基因又分為兩個剪切本(Transcript),根據(jù)其cDNA堿基數(shù)分別命名為pkma-2404、pkma-2412,是同一基因pkma在轉(zhuǎn)錄過程中由前體mRNA經(jīng)過不同的選擇性剪切的產(chǎn)物。pkma-2412包含外顯子10,pkma-2404不含外顯子10但特異含有原內(nèi)含子9的一部分。通過生物信息學分析,我們發(fā)現(xiàn)在pkma和pkmb上都存在核定位信號,并且在序列上游都存在HRE。通過RT-PCR我們發(fā)現(xiàn)pkma-2404和pkmb在胚胎發(fā)育時期和成魚體內(nèi)都有表達,而pkma-2412只在胚胎發(fā)育早期和成魚體內(nèi)有表達。然后我們又通過對斑馬魚胚胎和成魚分別進行缺氧發(fā)現(xiàn)pkma和pkmb都受缺氧調(diào)控,將帶有GFP標簽的表達質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染到HEK293T細胞,以p2.1作為報告質(zhì)粒,然后檢測雙熒光素酶的活性發(fā)現(xiàn),Pkma能使雙熒光素酶的活性顯著上升,說明Pkma能與HIF-1α相互作用。我們通過瞬時轉(zhuǎn)染Hela細胞還發(fā)現(xiàn),Pkma和Pkmb在缺氧條件下可以進入到細胞核。之后,我們通過斑馬魚胚胎過表達HIF-1α發(fā)現(xiàn),過表達HIF-1α能上調(diào)pkma mRNA的表達水平,推測pkma是HIF-1α的靶基因。綜上所述,斑馬魚pkm基因是受缺氧調(diào)控的,從體內(nèi)實驗證明了pkma可能是HIF-1α的靶基因,并且我們對pkm在胚胎發(fā)育早期的功能也有了一定的認識。
【關(guān)鍵詞】：M型丙酮酸激酶 缺氧誘導(dǎo)因子-1α 缺氧 斑馬魚
【學位授予單位】：中國海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：Q55;R363
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-12
• 1 前言12-28
• 1.1 模式動物——斑馬魚12-13
• 1.2 丙酮酸激酶(PK)13-18
• 1.2.1 丙酮酸激酶簡介13
• 1.2.2 PKM的可變剪接機制13
• 1.2.3 PKM2的活性13-14
• 1.2.4 PKM2在基因轉(zhuǎn)錄和腫瘤發(fā)生的功能14-16
• 1.2.5 核定位信號與PKM2的進核機制16-18
• 1.2.6 PKM2作為治療腫瘤的新靶點18
• 1.3 斑馬魚pkm基因18
• 1.4 缺氧與缺氧誘導(dǎo)因子(HIFs)18-24
• 1.4.1 缺氧18-19
• 1.4.2 缺氧手段19
• 1.4.3 生物體對缺氧的應(yīng)答機制19-20
• 1.4.4 HIF-1的結(jié)構(gòu)20
• 1.4.5 HIF-1的活性20-21
• 1.4.6 缺氧反應(yīng)元件(Hypoxia Response Elements,HRE)21
• 1.4.7 HIF一1的靶基因21
• 1.4.8 HIF-1與PKM2的關(guān)系21-23
• 1.4.9 HIF-1α與腫瘤的關(guān)系23-24
• 1.5 CRISPR/Cas9技術(shù)24-25
• 1.6 本論文的立題依據(jù)25-27
• 1.7 本論文的研究意義27-28
• 2 斑馬魚pkm在早期胚胎發(fā)育的研究28-55
• 2.1 實驗材料與方法28-43
• 2.1.1 實驗材料28
• 2.1.2 主要化學和生物試劑28
• 2.1.3 實驗儀器28-29
• 2.1.4 實驗方法29-43
• 2.2 實驗結(jié)果43-51
• 2.2.1 斑馬魚pkma/pkmb的序列分析43-44
• 2.2.2 斑馬魚pkma/pkmb的時空表達譜分析44-45
• 2.2.3 缺氧對斑馬魚成魚和胚胎pkm mRNA表達水平的影響45-46
• 2.2.4 斑馬魚Pkma與HIF-1α有相互作用46-49
• 2.2.5 pkma是HIF-1α的靶基因49-50
• 2.2.6 利用Cas9技術(shù)構(gòu)建Pkmb敲除的突變體50-51
• 2.3 總結(jié)與討論51-55
• 2.3.1 pkma/pkmb在斑馬魚胚胎發(fā)育早期有表達51-52
• 2.3.2 缺氧能上調(diào)pkma/pkmb的表達以及Pkma/Pkmb和HIF-1α相互作用52-53
• 2.3.3 缺氧能誘導(dǎo)Pkma/Pkmb入核53-54
• 2.3.4 運用Cas9基因敲除技術(shù)構(gòu)建Pkma/Pkmb功能缺失的突變體54-55
• 3 展望55-57
• 3.1 確定pkma/pkmb在斑馬魚胚胎發(fā)育中的功能及機制55
• 3.2 探究Pkma/Pkmb是否和HIF-1α相互作用55-56
• 3.3 Pkma/Pkmb在胚胎發(fā)育中的作用是否與HIF信號通路相關(guān)56-57
• 參考文獻57-62
• 致謝62-64
• 個人簡歷64
• 發(fā)表的學術(shù)論文64

【相似文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 周炳;趙美蓉;黃海鳳;;4種農(nóng)藥對斑馬魚胚胎的毒理研究[J];浙江工業(yè)大學學報;2008年02期

2 ;法國科學家發(fā)現(xiàn)斑馬魚造血干細胞生成機理[J];廣西科學院學報;2010年01期

3 陳粉麗;張松林;李運彩;;斑馬魚胚胎毒理學研究進展[J];湖北農(nóng)業(yè)科學;2010年06期

4 劉在平;張松林;;斑馬魚在環(huán)境保護中的應(yīng)用[J];中國環(huán)境監(jiān)測;2011年04期

5 王雪;王希敏;劉可春;韓利文;袁延強;;斑馬魚胚胎在毒理學研究中的應(yīng)用[J];山東科學;2011年06期

6 劉麗麗;王健;王海勝;余凱敏;李國超;閆艷春;;斑馬魚轉(zhuǎn)基因平臺的建立[J];生物技術(shù)通報;2013年10期

7 朱琳,史淑潔;斑馬魚胚胎發(fā)育技術(shù)在毒性評價中的應(yīng)用[J];應(yīng)用生態(tài)學報;2002年02期

8 董武,楊景峰,王思珍,高原,解顏炯,馬國文;二VA英污染引起的特異性下頜短小—斑馬魚下頜形態(tài)學檢測[J];內(nèi)蒙古民族大學學報(自然科學版);2005年03期

9 蔡翔,王捷,王穎;應(yīng)用胚胎檢測技術(shù)評價氟嗎啉對斑馬魚胚胎-幼體發(fā)育的影響[J];農(nóng)藥;2005年06期

10 張立鳳;鐘濤;桂永浩;;外源性視黃酸對斑馬魚心血管系統(tǒng)發(fā)育的影響[J];中國實驗動物學報;2006年02期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 馬雯雯;杭曉明;王巍;劉聰;孫野青;;模擬微重力影響斑馬魚胚胎發(fā)育的蛋白質(zhì)組特征[A];“基因、進化與生理功能多樣性”海內(nèi)外學術(shù)研討會暨中國生理學會第七屆比較生理學學術(shù)會議論文摘要[C];2009年

2 張利軍;史慧勤;彭雙清;;基于斑馬魚模式動物的阿霉素心臟毒性作用研究[A];2010年全國藥物毒理學學術(shù)會議論文集[C];2010年

3 王晗;;斑馬魚生物鐘調(diào)節(jié)的分子遺傳和基因組機制[A];2011年全國時間生物醫(yī)學學術(shù)會議論文集[C];2011年

4 林秀坤;;斑馬魚作為抗腫瘤藥物模型的分子基礎(chǔ)[A];第四屆中國腫瘤大會中國藥理學會腫瘤藥理專業(yè)委員會分會場學術(shù)會議論文摘要[C];2006年

5 侯佳;桂永浩;張立鳳;王躍祥;宋后燕;鐘濤;;視黃酸缺乏對斑馬魚胚胎心臟發(fā)育的影響[A];中華醫(yī)學會第五次全國兒科中青年學術(shù)交流大會論文匯編（上冊）[C];2008年

6 陳錫強;韓利文;王希敏;王思鋒;侯海榮;劉可春;;促滲劑氮酮對斑馬魚胚胎的透皮作用及其毒性影響(英文)[A];2012年中國藥學大會暨第十二屆中國藥師周論文集[C];2012年

7 于永利;楊景峰;王思珍;董武;;高殘留農(nóng)藥福美雙對斑馬魚胚胎體節(jié)以及脊索的影響[A];持久性有機污染物論壇2010暨第五屆持久性有機污染物全國學術(shù)研討會論文集[C];2010年

8 巴雅斯胡;楊景峰;于永利;王思珍;董武;;高殘留農(nóng)藥代森鋅誘導(dǎo)斑馬魚胚胎脊索變形[A];持久性有機污染物論壇2011暨第六屆持久性有機污染物全國學術(shù)研討會論文集[C];2011年

9 張利軍;郭家彬;苑曉燕;史慧勤;趙君;束玉磊;彭雙清;;應(yīng)用斑馬魚胚胎和幼魚評價布洛芬的心臟毒性[A];2013年（第三屆）中國藥物毒理學年會暨藥物非臨床安全性評價研究論壇論文摘要[C];2013年

10 朱小山;朱琳;李燕;端正花;;富勒烯(C_(60))對斑馬魚胚胎發(fā)育毒性的初步研究[A];第三屆全國環(huán)境化學學術(shù)大會論文集[C];2005年

中國重要報紙全文數(shù)據(jù)庫 前8條

1 劉妍;美國培育出終生透明的斑馬魚[N];中國漁業(yè)報;2008年

2 本報記者 滕繼濮;小小斑馬魚 大大有用處[N];科技日報;2010年

3 楓葉　編譯;篩選藥物：斑馬魚責任重大[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2012年

4 記者 熊琳暉 通訊員 孫慧;研究斑馬魚揭示器官再生之謎[N];長江日報;2013年

5 羅剛 李兵;斑馬魚破譯人類基因的先鋒[N];健康報;2004年

6 記者 李學梅;斑馬魚為治療白血病提新思路[N];新華每日電訊;2010年

7 本報記者 許琦敏;靜候那一點流星似的光亮[N];文匯報;2012年

8 本報記者 許琦敏;劉廷析 “掘?qū)殹卑唏R魚世界[N];文匯報;2011年

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 管翊閎;核仁因子Def磷酸化修飾調(diào)控細胞周期和p53降解的研究[D];浙江大學;2015年

2 胡晶瑩;環(huán)境雌激素影響斑馬魚生殖系統(tǒng)發(fā)育機制的初步研究[D];復(fù)旦大學;2011年

3 趙婷;Karsch-Neugebauer綜合征斑馬魚模型的建立和行為學觀察[D];復(fù)旦大學;2014年

4 王健;新型斑馬魚模型在研究腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移和血管侵襲機制中的應(yīng)用[D];山東大學;2015年

5 王明勇;斑馬魚生物鐘基因per2突變體的構(gòu)建及在生物鐘系統(tǒng)中的功能分析[D];蘇州大學;2014年

6 龔璐;p53及其異構(gòu)體△133p53/△113p53在人類細胞和斑馬魚中的功能及生物學意義研究[D];浙江大學;2015年

7 郭翠翠;斑馬魚D3b基因結(jié)構(gòu)及其在胚胎發(fā)育中的作用研究[D];上海交通大學;2014年

8 沈兵;致癌染料的生理毒性及分子機制研究[D];浙江大學;2015年

9 張慶友;斑馬魚Mil/s1pr2和vmhc基因的功能研究及藥源性心臟毒性模型的建立[D];北京協(xié)和醫(yī)學院;2011年

10 楊梅;乙草胺對斑馬魚的發(fā)育和生殖內(nèi)分泌干擾機制研究[D];浙江大學;2015年

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 崔俊安;稀土對斑馬魚胚胎發(fā)育的影響[D];青島科技大學;2011年

2 吳二社;nano-TiO_2,nano-Ag對斑馬魚胚胎發(fā)育的毒理學研究[D];西北師范大學;2012年

3 溫鼎聲;利用模式生物斑馬魚對化合物心臟毒性和急毒性篩選的研究[D];華南理工大學;2012年

4 梁榮朝;丙烯酰胺對斑馬魚生物余能的影響及對其肝、鰓毒性的作用[D];哈爾濱商業(yè)大學;2013年

5 海洋;魚藤素對斑馬魚胚胎CyclinD1的表達調(diào)控及相關(guān)抗腫瘤機制研究[D];華南理工大學;2015年

6 蔣宇霞;東江流域沉積物生物毒性及其沉積物質(zhì)量綜合評價[D];中國科學院研究生院(廣州地球化學研究所);2015年

7 袁忠月;殼聚糖納米載體對神經(jīng)系統(tǒng)影響的研究[D];浙江大學;2015年

8 余凱敏;毒死蜱對斑馬魚胚胎的毒性機制研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學院;2015年

9 羅茜;斑馬魚生長抑素-1基因靶向敲降和營救以及基于表達譜的胚胎發(fā)育功能分析[D];西南大學;2015年

10 胡月陽;UBE2C基因在斑馬魚胚胎發(fā)育中的時空表達規(guī)律[D];河北醫(yī)科大學;2015年

  本文關(guān)鍵詞：斑馬魚M型丙酮酸激酶功能的初步研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：273728