【摘要】：間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal Stem Cells, MSC）具有免疫調(diào)節(jié)和分泌細(xì)胞因子等功能，在細(xì)胞治療和組織工程中具有重要的應(yīng)用價(jià)值，是目前除了造血干細(xì)胞之外臨床應(yīng)用研究最多、最成熟的一種成體干細(xì)胞。間充質(zhì)干細(xì)胞在組織中的豐度很低，要達(dá)到臨床應(yīng)用的數(shù)量級(jí)，就必須進(jìn)行體外的擴(kuò)增培養(yǎng)。胎牛血清常用作為細(xì)胞培養(yǎng)的營(yíng)養(yǎng)和刺激物，可以實(shí)現(xiàn)MSC在體外的穩(wěn)定增殖。然而，胎牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的MSC，牛血清蛋白可被吞噬進(jìn)入細(xì)胞漿，從而殘留在細(xì)胞內(nèi)，在臨床治療過程中可能引起患者機(jī)體免疫反應(yīng)，造成血清病或其他免疫性疾病。此外，胎牛血清還具有明顯的批次間差異，從而影響MSC培養(yǎng)的穩(wěn)定性。因此，化學(xué)成份確定的無血清培養(yǎng)基是培養(yǎng)安全、穩(wěn)定的臨床應(yīng)用級(jí)MSC的趨勢(shì)。然而，由于無血清培養(yǎng)基中缺乏大量細(xì)胞生長(zhǎng)因子，間充質(zhì)干細(xì)胞增殖緩慢或不能增殖。更關(guān)鍵的是由于MSC是貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞，無血清培養(yǎng)基中缺乏各種粘附貼壁因子，如纖維連接蛋白、層粘連蛋白、膠原等，從而影響MSC的貼壁。因此，需要添加大量的細(xì)胞生長(zhǎng)因子和細(xì)胞基質(zhì)蛋白包括纖維連接蛋白、膠原和胎球蛋白，以維持MSC的增殖和貼壁。事實(shí)上，MSC是一種分泌型細(xì)胞，本身具有分泌很多細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子和一系列的細(xì)胞外基質(zhì)包括膠原和FN的能力。所以我們?cè)O(shè)想是否可以通過某種刺激，促進(jìn)MSC自身分泌細(xì)胞外基質(zhì)和增殖，從而解決MSC增殖和貼壁的問題？如果可行，這將為研究間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基提供一條新的思路。 通過文獻(xiàn)調(diào)研和預(yù)實(shí)驗(yàn)的篩選，我們選擇了臨床藥物凝血酶作為刺激物。凝血酶是絲氨酸蛋白酶家族成員，具有多種生物學(xué)功能，其不僅在凝血過程發(fā)揮作用外，還能誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生許多生物學(xué)效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)凝血酶能夠刺激腎小球基底膜細(xì)胞合成膠原和刺激人腎小球近端小管上皮細(xì)胞分泌FN，還能誘導(dǎo)肥大細(xì)胞更易于貼壁和促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和分泌神經(jīng)生長(zhǎng)因子等。本課題主要就凝血酶對(duì)MSC的作用及其可能的作用機(jī)制進(jìn)行探討，內(nèi)容包括凝血酶對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞分泌表達(dá)FN的作用及其作用的途徑，以及凝血酶對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞增殖及其他生物學(xué)特性的影響。 首先，我們利用傳統(tǒng)密度梯度分離和差速貼壁的方法，從健康供者骨髓中分離MSC，并經(jīng)流式鑒定和誘導(dǎo)分化鑒定后，作為實(shí)驗(yàn)研究用細(xì)胞。為了觀察凝血酶是否具有對(duì)MSC作用的可能性，我們通過PCR方法檢測(cè)MSC是否表達(dá)凝血酶受體——蛋白酶活化受體（Protease activated receptors, PAR）。結(jié)果顯示MSC表達(dá)凝血酶受體PAR1和PAR2，說明凝血酶有可能通過PAR1和PAR2對(duì)MSC發(fā)揮作用。 之后，我們通過PCR、免疫熒光和ELISA等方法，在mRNA、蛋白質(zhì)和細(xì)胞水平，分別檢測(cè)凝血酶刺激后MSC表達(dá)FN的情況，通過1h細(xì)胞自然貼壁試驗(yàn)檢測(cè)凝血酶刺激MSC后細(xì)胞貼壁率，PCR方法檢測(cè)細(xì)胞粘附分子ITGA。結(jié)果顯示，凝血酶作用后，MSC在RNA水平FN表達(dá)增高（是對(duì)照組3倍，p0.05）；分泌到細(xì)胞培養(yǎng)上清中的FN量明顯增高（p0.01），且具有明顯的時(shí)間效應(yīng)和濃度依賴性。同時(shí)，MSC細(xì)胞漿中FN表達(dá)量也明顯升高。經(jīng)過凝血酶預(yù)處理的MSC，貼壁能力明顯高于對(duì)照組（p0.01），與細(xì)胞粘附相關(guān)的因子ITGA5表達(dá)也增高。我們的結(jié)果說明，凝血酶可以促進(jìn)MSC表達(dá)和分泌FN，并提高M(jìn)SC貼壁能力。 為了進(jìn)一步研究凝血酶促進(jìn)MSC分泌FN的機(jī)制，通過WESTERNBLOTTING方法檢測(cè)凝血酶作用后信號(hào)通路激活情況。結(jié)果顯示，凝血酶作用后，ERK1/2信號(hào)通路發(fā)生快速磷酸化，在5min就達(dá)到峰值，并且至少持續(xù)60min。同時(shí)，凝血酶還誘導(dǎo)NFKB信號(hào)通路發(fā)生磷酸化，然而與ERK1/2信號(hào)通路不同的是，NFKB p65在60min才達(dá)到磷酸化的最高值。為了進(jìn)一步研究哪一條信號(hào)通路在凝血酶刺激FN分泌中起主要的作用，我們用NFKB、EKR信號(hào)通路特異性抑制劑丙酮酸酯（EP）和PD98059分別阻斷NFKB和ERK的活化，然后用ELISA檢測(cè)MSC分泌FN情況。結(jié)果顯示，當(dāng)NFKB和ERK被阻斷后，F(xiàn)N分泌均下降，尤其以ERK通路被阻斷后，抑制效果更明顯（p0.01）。而NFKB通路被阻斷后，雖然FN的分泌受到了明顯的抑制，但是，培養(yǎng)上清中FN的濃度仍然明顯高于無血清對(duì)照組（p0.05）。 為進(jìn)一步觀察凝血酶是通過哪個(gè)受體激活NFKB和ERK通路，我們用PAR1和PAR2受體特異性抑制劑SCH79797和FSLLRY-NH2，分別阻斷PAR1和PAR2受體，觀察凝血酶處理后MSC信號(hào)通路以及分泌FN的變化。結(jié)果顯示，PAR1受體被阻斷后，ERK信號(hào)通路快速磷酸化（5min）不受影響，但是其持續(xù)磷酸化作用被抑制，，F(xiàn)N分泌量較凝血酶單獨(dú)刺激對(duì)照組降低（p0.05），但仍然高于無血清對(duì)照組（p0.05）；而PAR2受體被抑制后，ERK信號(hào)通路被明顯抑制，同時(shí)FN分泌量被明顯抑制（p0.01），與無血清對(duì)照組相比無明顯差異。結(jié)果還顯示，PAR受體抑制劑對(duì)NFKB信號(hào)通路磷酸化影響不大。由此推測(cè)，凝血酶可能通過PAR受體激活ERK通路促進(jìn)FN的分泌表達(dá)，同時(shí)還可能通過其它間接通路激活NFKB信號(hào)通路，影響FN的分泌表達(dá)。 此外，我們通過MTT方法和CFSE標(biāo)記MSC流式細(xì)胞術(shù)的方法，觀察了凝血酶對(duì)MSC增殖的影響，分析了經(jīng)凝血酶刺激培養(yǎng)的MSC，其細(xì)胞表面標(biāo)志物CD31, CD34, CD45, CD44, CD73, CD90, CD105和HLA-DR的表達(dá)，和α-tubulin免疫熒光方法分析MSC的細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)情況，以及MSC的體外分化能力和免疫調(diào)節(jié)功能的變化。MTT結(jié)果顯示，凝血酶可顯著刺激MSC增殖，效應(yīng)呈濃度依賴性；當(dāng)凝血酶濃度為0.5U/ml時(shí)，細(xì)胞增殖明顯提高(p0.05)，濃度為8U/ml時(shí)，刺激活性達(dá)峰值（p0.01）。流式結(jié)果顯示，凝血酶作用后MSC增殖代數(shù)明顯增加，增殖指數(shù)較對(duì)照組增高（P0.01），驗(yàn)證了凝血酶具有促進(jìn)MSC增殖的作用。而經(jīng)凝血酶刺激培養(yǎng)的MSC細(xì)胞表面標(biāo)志物、細(xì)胞骨架沒有發(fā)生明顯改變，并且依然保持誘導(dǎo)分化成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞的能力和抑制異體淋巴細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化能力。 為了研究凝血酶促進(jìn)MSC增殖的機(jī)制，探討PAR受體在凝血酶促進(jìn)MSC增殖中的作用，我們使用PAR受體特異性抑制劑SCH79797和FSLLRY-NH2分別阻斷PAR1和PAR2受體，觀察凝血酶對(duì)MSC增殖作用的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)PAR1受體被阻斷后，凝血酶促進(jìn)MSC增殖的作用被抑制（p0.05）；當(dāng)PAR2受體被抑制后，凝血酶促M(fèi)SC增殖作用不受明顯影響。凝血酶作用后，AKT信號(hào)通路被激活，而當(dāng)AKT信號(hào)通路被抑制后，細(xì)胞增殖也被完全抑制。此外，凝血酶還能通過PAR1受體激活ERK1/2信號(hào)通路，通過特異性抑制劑證實(shí)，ERK1/2信號(hào)通路也與凝血酶促進(jìn)MSC增殖作用有關(guān)。PCR方法檢測(cè)細(xì)胞增殖相關(guān)的基因表達(dá)發(fā)現(xiàn)，凝血酶作用后與調(diào)控細(xì)胞增殖相關(guān)的c-MYC、EGR1基因表達(dá)上調(diào)，并分別被AKT信號(hào)通路抑制劑和ERK1/2信號(hào)通路抑制劑抑制。由此推斷，在無血清培養(yǎng)基中添加凝血酶，可以通過PAR1受體激活A(yù)KT信號(hào)通路，上調(diào)c-MYC基因表達(dá)；通過PAR1受體激活ERK1/2信號(hào)通路，上調(diào)EGR1基因表達(dá)，促進(jìn)MSC增殖。 上述研究結(jié)果可以得出如下結(jié)論：（1）凝血酶可以通過PAR受體介導(dǎo)的ERK1/2信號(hào)通路磷酸化，促進(jìn)MSC自身FN的表達(dá)和分泌，并且間接激活的NFKB信號(hào)通路也參與了促進(jìn)MSC表達(dá)和分泌FN的過程；（2）凝血酶可促進(jìn)MSC在無血清培養(yǎng)基中的貼壁能力和粘附分子ITGA5的表達(dá)；（3）凝血酶可通過MSC表面PAR1受體，激活A(yù)KT和ERK1/2信號(hào)通路，上調(diào)c-MYC、EGR1基因的表達(dá)，促進(jìn)MSC的增殖。研究也表明，經(jīng)凝血酶刺激的MSC仍然保持其原有的生物學(xué)特性，具有分化成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和免疫抑制能力。以上結(jié)果為研究適用于臨床級(jí)MSC培養(yǎng)的無血清體系，提供了一種新的策略。當(dāng)然，新培養(yǎng)體系進(jìn)入臨床應(yīng)用前，仍需要進(jìn)行更深入的研究，以探討新體系所培養(yǎng)細(xì)胞的安全性和穩(wěn)定性等。
【圖文】：

數(shù)據(jù)采用 SPSS13.0 或 GraphPad Prism 6 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。定量資料以X±SD 表示。實(shí)驗(yàn)組間采用單因素方差分析(ANOVO)，方差齊性且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)，采用 Dunnett's 多重比較檢驗(yàn)方法對(duì)組間進(jìn)行分析，p<0.05 認(rèn)為具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié) 果3. 結(jié)果3.1 骨髓 MSC 分離培養(yǎng)結(jié)果骨髓一直是 MSC 的主要來源之一，大約每萬分之一到百萬分之一個(gè)骨髓單個(gè)核細(xì)胞中含有一個(gè)原始 MSC，我們采用經(jīng)典的梯度密度離心和差速貼壁的方法成功的分離 MSC 并擴(kuò)增培養(yǎng)。光學(xué)顯微鏡下觀察，培養(yǎng)第 3 天可見少量貼壁的紡錘形細(xì)胞和其他血細(xì)胞（圖 1-1A），第 7-10 天可見細(xì)胞呈集落樣生長(zhǎng)（圖 1-1B），第 12-14 天可見集落呈較大的成纖維樣、魚群狀生長(zhǎng)（圖 1-1C）。經(jīng)消化傳代后，獲得均一的細(xì)胞。（見圖 1-1D）A B

碩士論文 第一部分：凝血酶促進(jìn) MSC 分泌纖維連接蛋白及機(jī)制3.2 骨髓 MSC 流式鑒定結(jié)果根據(jù)國(guó)際細(xì)胞治療協(xié)會(huì)關(guān)于 MSC 鑒定的標(biāo)準(zhǔn)，我們對(duì)獲得的 MSC 進(jìn)行流式細(xì)胞分析表面標(biāo)志物表達(dá)情況。結(jié)果顯示，獲得的細(xì)胞高表達(dá) CD44, CD73, CD90,CD105, 不表達(dá) CD34, CD45, CD31 和 HLA-DR （見圖 1-2），符合 MSC 的表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R329.2

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本文編號(hào)：2574705