【摘要】：目的(1)研究Hsp104是不是可以阻止異常朊蛋白的聚集或者對異常朊蛋白的聚集具有解聚作用,為研究PrPsc聚集體或單體對神經(jīng)細胞是具有保護作用還是毒性作用具有一定的意義；(2)根據(jù)PrP106-126肽具有聚集成纖維的特點,將其作為PrPsc聚集的模式,擬通過Hsp104干擾PrP106-126纖維形成,來探討PrPsc聚集形成的機制。 方法(1)利用原核表達系統(tǒng)表達全長Hsp104蛋白；(2)PrP106-126肽用緩沖液溶解,然后把樣品分成兩組,一組加Hsp104蛋白5μM,另一組未加Hsp104蛋白。每組各6個樣品,370C,分別孵育Oh、12h、24h、48h、72h和96h；(3)采用熒光光譜法(ThT分析法)、透射電子顯微鏡、原子力顯微鏡、圓二色譜法和MTT比色法對樣品進行檢測。結(jié)果利用原核表達系統(tǒng)成功表達了全長Hsp104蛋白；在體外實驗過程中證實PrP106-126可以形成纖維,而且隨著孵育時間的延長,纖維越來越細,相互交織形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。PrP106-126肽在不同的細胞(如HeLa細胞和SK細胞)中具有相似的毒性。而且也發(fā)現(xiàn)PrP106-126肽聚集成纖維后比PrP106-126肽對細胞的毒性要低。當(dāng)Hsp104存在時PrP106-126肽可以保持其對細胞的毒性。并且能夠明顯的抑制PrP106-126纖維的形成,同時其解聚作用也很明顯。其作用機制是通過改變PrP106-126肽的二級結(jié)構(gòu)從p-折疊結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變成無規(guī)卷曲,而使已經(jīng)聚集形成的纖維發(fā)生解聚,從而可以拮抗PrP106-126肽纖維聚集的形成來阻止淀粉樣轉(zhuǎn)變。從而保持PrP106-126肽對細胞的毒性。 結(jié)論利用原核表達系統(tǒng)成功表達全長熱休克蛋白Hsp104蛋白；從動力學(xué)、形態(tài)學(xué)、二級結(jié)構(gòu)三方面證實熱休克蛋白Hsp104在體外可抑制PrP106-126肽聚集形成纖維；體外細胞毒性實驗證實熱休克蛋白Hsp104能夠抑制PrP106-126肽聚集形成纖維,還可維持PrP106-126肽的細胞毒性作用；體外動力學(xué)實驗證實熱休克蛋白Hsp104對PrP106-126肽形成的纖維具有解聚作用；體外細胞毒性實驗證實熱休克蛋白Hsp104能夠使PrP106-126肽聚集形成的纖維解聚成PrP106-126肽或低聚物,誘導(dǎo)細胞毒性作用。
【圖文】：

BCD圖1Hsplo4六聚體結(jié)構(gòu)模型(引自Jamesshorter，NeurosignalsZoos:26:65)圖AHsP104結(jié)構(gòu)簡圖圖BHsPlo4六聚體結(jié)構(gòu)的三維圖圖cHsp104六聚體結(jié)構(gòu)的俯視圖圖DHsP104六聚體結(jié)構(gòu)的側(cè)面圖

圖2AFM工作原理圖Fig2.SehematicmodeldeseribingthePrineiPleofAFM.電子顯微鏡(E一eetronMieroseopy)法觀察為了觀察Hspl04對prp106一126淀粉樣纖維形成的影響，我們將Hspl04蛋白
【學(xué)位授予單位】：安徽理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R346

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本文編號：2574755