目的:腦卒中是大多數(shù)西方國家繼缺血性心臟病之后的第二位死亡原因,但是在中國,腦卒中已成為居民的首位死因。中國每年約有160萬人死于腦卒中,已成為嚴重影響國計民生的重要公共衛(wèi)生問題。高血壓是腦卒中發(fā)病的最重要危險因素,我國高血壓人群基數(shù)十分龐大,與腦卒中關系密切,因此,高血壓人群是腦卒中一級預防最重要的目標人群。隨著技術的發(fā)展,代謝組學逐漸在心腦血管疾病領域表現(xiàn)出其應用潛力。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)血漿代謝產(chǎn)物與高血壓或腦卒中之間存在顯著的關聯(lián)。如果在我國高血壓人群中能夠找到一種或一組敏感而且特異的代謝標志物來預示腦卒中的發(fā)生,必將對腦卒中的一級預防產(chǎn)生巨大影響。高血壓發(fā)展為腦卒中是一個較長的過程,在這個時間內,心腦血管系統(tǒng)可能發(fā)生多種變化,最終導致卒中。其中,氧化應激過程被認為是腦卒中發(fā)生的重要機制之一,干預氧化應激過程可以起到預防或治療腦卒中的作用。然而,目前國內外尚無高血壓人群并發(fā)腦卒中的代謝組學研究,亦缺乏相關機制的報道。高血壓所致卒中機制復雜,不同于單純腦卒中,且中國高血壓人群腦卒中發(fā)生率明顯高于歐美人群,現(xiàn)有的證據(jù)均不能充分解釋這種差異。因此,本研究首先利用既往已建立的隊列,探索東北地區(qū)2004年-2016年高血壓人群腦卒中發(fā)病的流行趨勢,然后進一步以腦卒中作為唯一終點事件,通過巢式病例對照研究分析血漿非靶向代謝組學與高血壓腦卒中的發(fā)病關系,旨在找到一組與高血壓并發(fā)腦卒中相關的代謝物,最后在細胞和動物實驗中探討代謝物是否通過氧化應激機制影響腦卒中的發(fā)病。研究方法:第一部分:利用既往在遼寧省農(nóng)村地區(qū)已建立的兩個自然人群隊列三次隨訪數(shù)據(jù)(2004-2008年、2008-2010年及2013-2016年),收集新發(fā)腦卒中病例,計算年齡調整的腦卒中人年發(fā)病率,使用Cox比例風險模型計算年齡調整的腦卒中發(fā)病率的風險比(hazard ratio,HR)和95%可信區(qū)間(confidence interval,CI),分析2004年-2016年東北地區(qū)高血壓人群腦卒中的發(fā)病趨勢。第二部分:在課題組前期建立的隊列中選取符合條件的高血壓患者,隨機抽取90例高血壓并發(fā)腦卒中病例,并按照1:1匹配,從該隊列中隨機選取同等隨訪期限且未發(fā)生腦卒中的符合匹配條件的研究對象作為對照。采用超高效液相色譜-質譜聯(lián)用法,從正離子和負離子兩種電離模式,對所有納入病例的基線血漿進行非靶向代謝組學檢測。原始數(shù)據(jù)轉換后,進行單變量和多變量統(tǒng)計分析,并利用受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve,ROC)分析、通路富集分析等方法,篩選與高血壓腦卒中發(fā)病相關的代謝物及其通路。第三部分:根據(jù)前一部分篩選結果,選取差異代謝物植物鞘氨醇進一步實驗。分別5μM、10μM及50μM濃度的植物鞘氨醇處理人臍靜脈血管內皮細胞(HUVEC)24h,通過CCK8檢測細胞活性。再用植物鞘氨醇5μM、10μM及50μM處理細胞24h并且給與H_2O_2 500μM處理12h,采用CCK8檢測細胞活性,Western blot檢測氧化應激指標丙二醛(MDA)和內質網(wǎng)應激指標葡萄糖調節(jié)蛋白78(GRP78)的表達水平。進一步選取8周齡雄性卒中易感型自發(fā)性高血壓大鼠(SHRSP)進行實驗。SHRSP大鼠16只隨機分為兩組,實驗組給與生理鹽水+植物鞘氨醇(0.01mg/g)+10%DMSO(SHRSP-PHS組,n=8),對照組給與生理鹽水+10%DMSO(SHRSP-Con組,n=8),灌胃8周,另選取性別與周齡匹配的Wistar大鼠作為正常對照組(WKY組,n=8)。所有大鼠均給與日本高鹽低鉀飼料配方喂養(yǎng),以加速腦卒中發(fā)生。尾套法測量大鼠收縮壓,ELISA法檢測干預4周和8周的血漿MDA和過氧化物歧化酶(SOD)水平,記錄大鼠腦卒中臨床表現(xiàn)評分,大體及HE染色觀察大鼠腦組織結構變化。結果:第一部分:本研究納入人群包括2004-2008年隊列(13,626名高血壓患者)、2008-2010年隊列(13,241名高血壓患者)和2013-2016年隊列(4,321名高血壓患者)。男性中,年齡標化的腦卒中人年發(fā)病率由2004年的686/10萬增長到2008年的1362.6/10萬和2013年隊列的1760.4/10萬。女性中同樣,腦卒中人年發(fā)病率由2004年的563.3/10萬增長到2008年的617.2/10萬和2013年的1386.3/10萬,均呈明顯上升態(tài)勢。相比2004年,2008-2010年男性高血壓患者腦卒中發(fā)病率增長了79.8%(HR和95%CI:1.798,1.427-2.264),2013-2016年腦卒中發(fā)病率增長了162.3%(HR和95%CI:2.623,2.013-3.418)。在女性中,與2004年相比,2013-2016年腦卒中發(fā)病率增長了172.5%(HR和95%CI:2.725,2.027-3.662)。其中,主要的增長均來自缺血性腦卒中。第二部分:病例組與對照組的年齡、性別和基線血壓分級構成一致。兩組之間體質指數(shù)、腰圍、總膽固醇、甘油三酯、低密度和高密度脂蛋白、空腹血糖、吸煙及飲酒率亦無差異(P均0.05)。非靶向代謝組學整體數(shù)據(jù)質量良好,在有明確定性信息的有效代謝物中,正離子模式下運用CARS法篩選出了121個代謝物,負離子模式下篩選出了66個代謝物。高血壓并發(fā)腦卒中的患者血漿代謝產(chǎn)物明顯不同于未發(fā)生腦卒中的患者。應用PLS-DA模型的VIP值1且單變量分析P0.05作為篩選標準,共篩選出16個內源性差異性代謝物,其中7個代謝物下調,包括2-甲基二氫吡咯、DL-二氫鞘氨醇、植物鞘氨醇、辛酰基溶血磷脂酰膽堿、油酰乙基酰胺、5β-雄甾烷-3α-醇-17-酮硫酸鹽和甘油,9個代謝物上調,包括DL-吲哚-3-乳酸、十五酰基溶血磷脂酰膽堿、亞麻�；苎字Ｄ憠A、蓖麻酸甲酯、2-哌啶甲酸、棕櫚酸單甘油酯、花生四烯酸甲酯、1α-羥基-25,26,27-去三甲基補骨脂素24-羧酸和四氫醛固酮。所構建預測模型用于區(qū)分高血壓腦卒中與非腦卒中的ROC曲線下面積為0.843,95%CI為0.788-0.898。相關代謝通路包括鞘脂代謝、甘油脂代謝、甘油磷脂代謝、半乳糖代謝、苯丙氨酸代謝及色氨酸代謝。亞組分析提示缺血性腦卒中的差異代謝物及代謝通路有一部分區(qū)別于整體腦卒中。第三部分:細胞實驗:植物鞘氨醇5μM、10μM及50μM三個濃度對HUVEC細胞增殖活力均沒有顯著影響。用植物鞘氨醇預處理后,H_2O_2誘導的細胞損傷明顯緩解,并且隨著濃度的增加,細胞活力逐漸升高。500μM H_2O_2處理HUVEC細胞12h后,細胞MDA水平明顯增高。相比對照組,植物鞘氨醇干預組(5μM、10μM及50μM)細胞MDA的產(chǎn)生減少,并隨著植物鞘氨醇濃度的增加而遞減,同時,內質網(wǎng)應激蛋白GRP78的產(chǎn)生也明顯減少。動物實驗:隨著大鼠周齡的增長,各組動物體重均有增加,三組大鼠體重無顯著性差異。灌胃8周后,SHRSP-PHS和SHRSP-Con組大鼠血壓分別為228±7 mmHg和226±9 mmHg,兩組之間收縮壓無顯著性差異(P0.05)。干預4周后,SHRSP-PHS和SHRSP-Con組血漿MDA及SOD水平未見統(tǒng)計學差異。干預8周后,與SHRSP-Con組相比,SHRSP-PHS組血漿MDA水平顯著降低(P0.05),SOD水平顯著升高(P0.05),隨訪至干預8周后,SHRSP-Con和SHRSP-PHS組分別有3只和2只大鼠死亡。干預8周后WKY組無大鼠發(fā)生卒中,SHRSP-PHS組和SHRSP-Con組均100%發(fā)生臨床卒中。SHRSP-Con組腦組織出血和缺血性改變多于SHRSP-PHS組。與SHRSP-Con組相比,SHRSP-PHS組臨床卒中評分有下降趨勢。結論:本研究首次發(fā)現(xiàn)近十年,東北農(nóng)村地區(qū)高血壓人群腦卒中發(fā)病呈快速上升趨勢,男性發(fā)病率始終高于女性,總發(fā)病率較十年前增長了約1.6倍,缺血性腦卒中發(fā)病率較十年前增加了3倍左右,出血性腦卒中發(fā)病率未見明顯增長。高血壓未來發(fā)生腦卒中的患者血漿代謝圖譜明顯區(qū)別于未發(fā)生腦卒中的患者,多種代謝物及代謝通路可能參與高血壓腦卒中的發(fā)病過程,這些代謝物的組合可以較好的預測高血壓腦卒中的發(fā)生。其中,植物鞘氨醇能夠改善SHRSP大鼠腦的結構與功能,改善臨床腦卒中癥狀,并且可能通過抗氧化應激損傷的機制起到保護腦卒中的作用。本研究為高血壓腦卒中的預防和機制探索提供了新的方向。
【學位單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R743.3;R544.1
【部分圖文】：

圖 2. 不同性別年齡標化的腦卒中人年發(fā)病率 2004 年-2016 年東北地區(qū)高血壓人群腦卒中發(fā)病風險相比 2004年，2008-2010 年男性高血壓患者腦卒中發(fā)病率增長了 79.8% CI: 1.798, 1.427-2.264)，2013-2016 年腦卒中發(fā)病率增長了 162.3% (HR a2.623, 2.013-3.418)，見表 3 。在女性中，與 2004 年相比，2013-2016 年

中國醫(yī)科大學博士學位論文3 結果3.1 研究對象納入流程及基本資料本研究基于 NCRCHS 人群，平均隨訪 4.52 年。納入了其中的 6,211 名基線高血壓患者，有 266 名患者因缺失聯(lián)系方式等原因而被排除，對余下的 5,945 名患者進行隨訪，排除 1,134 名基線已有心血管疾病的病例以及 769 名基線血壓控制良好或血標本無法應用的病例，最終，共有 4,042 名高血壓患者滿足納入標準，在所有新發(fā)腦卒中病例中隨機抽取 90 例，并按 1:1 匹配 90 例未發(fā)生腦卒中的病例，構成巢式病例對照研究，進行血漿非靶向代謝組學檢測，（圖 1）。

各組代表性樣本的總離子流圖
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本文編號：2838520