研究目的:1、探討谷氨酸興奮毒性損傷對(duì)PPARγ表達(dá)的影響及其可能的調(diào)節(jié)機(jī)制;2、通過谷氨酸損傷后PPARγ磷酸化修飾的變化,探討谷氨酸損傷后PPARγ的活性改變及其可能機(jī)制。3、觀察PPARγ激動(dòng)劑羅格列酮(Rosiglitazone)、吡格列酮(Pioglitazone)和MAPK/ERK1/2抑制劑U0126對(duì)谷氨酸興奮毒性損傷的影響,進(jìn)一步探討激活PPARγ或保護(hù)其活性對(duì)谷氨酸興奮毒性損傷的保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)方法:以成年健康雄性Sprague-Dawley大鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,進(jìn)行試驗(yàn)。1、SD大鼠隨機(jī)分為正常組、對(duì)照組、谷氨酸組、NMDA組,其中正常組為正常大鼠不予以任何處理,對(duì)照組為予以相同體積的安慰劑皮層注射,谷氨酸組及NMDA組予以不同濃度及不同時(shí)間處理,其中不同濃度處理組分別予以濃度為50、100、200 mmol/L的谷氨酸或NMDA各1μL皮層注射;不同時(shí)間處理組為注射200mmol/L谷氨酸或NMDA分別作用3、6、12、24h后處死。(1)Western blot法檢測(cè)谷氨酸或NMDA損傷后各組炎癥、凋亡相關(guān)蛋白COX-2、iNOS、cleaved caspase-3的表達(dá)變化。(2)免疫熒光染色法進(jìn)行炎癥、凋亡相關(guān)蛋白染色,觀察損傷后COX-2、iNOS、cleaved caspase-3信號(hào)強(qiáng)度的變化和細(xì)胞定位。(3)通過HE、TTC染色檢測(cè)谷氨酸或NMDA損傷后的組織學(xué)改變。2、SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、MK-801單獨(dú)處理組、谷氨酸組、MK-801處理組,其中對(duì)照組為予以相同體積的安慰劑(生理鹽水)皮層注射,MK-801單獨(dú)處理組只給予0.15mg/kg MK-801腹腔注射,谷氨酸組為200 mmol/L谷氨酸1μL皮層注射,MK-801處理組為在谷氨酸處理的基礎(chǔ)上,提前30min予以0.375、0.75、0.15mg/kg MK-801腹腔注射,動(dòng)物24h后處死。(1)Western blot法檢測(cè)MK-801對(duì)谷氨酸引起的炎癥、凋亡相關(guān)蛋白COX-2、iNOS、cleaved caspase-3表達(dá)變化。(2)HE染色法檢測(cè)MK-801對(duì)谷氨酸損傷后組織學(xué)改變的影響。3、SD大鼠隨機(jī)分為正常組、對(duì)照組、谷氨酸或NMDA組,處理方式同前。(1)Western blot法檢測(cè)谷氨酸損傷對(duì)PPARγ、pPPARγ、ERK1/2、pERK1/2表達(dá)的影響。(2)免疫熒光染色法進(jìn)行PPARγ與NeuN雙染,觀察谷氨酸損傷后PPARγ表達(dá)變化及細(xì)胞定位。4、SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、干預(yù)劑單獨(dú)處理組、谷氨酸或NMDA組、干預(yù)劑組。干預(yù)劑分別為MK-801腹腔注射、GSH鼠尾靜脈注射、BAPTA-AM、Calpeptin、Ac-DEVD-CHO皮層微量注射。對(duì)照組、谷氨酸或NMDA組處理同前,干預(yù)劑單獨(dú)處理組為只給予干預(yù)劑處理,干預(yù)劑組為在谷氨酸或NMDA(200mmol/L)處理的基礎(chǔ)上,提前30min予以各干預(yù)劑處理。Western blot法檢測(cè)各組PPARγ表達(dá)。5、SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、U0126單獨(dú)處理組、谷氨酸或NMDA組、U0126組。對(duì)照組、谷氨酸或NMDA組,處理方式同前。U0126單獨(dú)處理組為只給與U0126處理。U0126組為在谷氨酸或NMDA(200 mmol/L)的基礎(chǔ)上,提前30min予以U0126處理。Western blot法檢測(cè)ERK1/2激活抑制劑U0126對(duì)谷氨酸或NMDA引起的pPPARγ、ERK1/2、pERK1/2表達(dá)的影響。6、SD大鼠隨機(jī)分為正常組、對(duì)照組、保護(hù)劑單獨(dú)處理組、NMDA組、保護(hù)劑組。保護(hù)劑為Ros、Pio腹腔注射或U0126皮層注射。其中正常組、對(duì)照組、NMDA組處理同前,保護(hù)劑單獨(dú)處理組為只給予保護(hù)劑處理,保護(hù)劑組為在NMDA(200 mmol/L)的基礎(chǔ)上,提前30min予以保護(hù)劑處理。(1)HE、TTC染色法評(píng)價(jià)各保護(hù)劑對(duì)NMDA損傷的保護(hù)作用。(2)Western blot法檢測(cè)各組炎癥、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)變化。(3)免疫熒光染色法進(jìn)行炎癥、凋亡相關(guān)蛋白與NeuN雙染,觀察保護(hù)劑對(duì)谷氨酸損傷后的保護(hù)作用及細(xì)胞定位。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1、谷氨酸興奮毒性損傷模型評(píng)價(jià):(1)Western blot法檢測(cè)顯示,谷氨酸或NMDA引起COX-2、iNOS、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)增加,而MK-801可抑制谷氨酸引起的上述蛋白表達(dá)增加(P0.05,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)。(2)免疫熒光染色結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,谷氨酸或NMDA組COX-2、iNOS、cleaved caspase-3蛋白信號(hào)強(qiáng)度增強(qiáng)(P0.05)。(3)HE染色顯示谷氨酸或NMDA處理引起的皮層損傷,且這種損傷可被MK-801抑制,提示谷氨酸興奮毒性損傷主要通過NMDA受體介導(dǎo)。2、谷氨酸對(duì)PPARγ的調(diào)節(jié)作用:(1)谷氨酸處理:1)Western blot法檢測(cè)顯示,與對(duì)照組相比,PPARγ表達(dá)呈時(shí)間及劑量依賴性增加(P0.05,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)。2)免疫熒光染色法顯示,與對(duì)照組相比,PPARγ蛋白信號(hào)強(qiáng)度增強(qiáng),且大部分可與NeuN信號(hào)疊加,提示主要表達(dá)于神經(jīng)元細(xì)胞中。(2)NMDA處理:Western blot法檢測(cè)顯示,與對(duì)照組相比,PPARγ表達(dá)呈時(shí)間及劑量依賴性增加(P0.05,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義),與谷氨酸作用一致。(3)MK-801處理:Western blot法檢測(cè)顯示,MK-801可明顯抑制谷氨酸引起的PPARγ表達(dá)增加,作用具有劑量依賴性,提示谷氨酸對(duì)PPARγ的作用主要通過NMDA受體介導(dǎo)。(4)其它處理:Western blot法檢測(cè)顯示,與NMDA組比較,隨著GSH、BAPTA-AM、Calpeptin、Ac-DEVD-CHO提前給予,NMDA引起的PPARγ表達(dá)增加被抑制(P0.05,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義),提示谷氨酸對(duì)PPARγ的作用與氧化應(yīng)激、鈣離子-calpain-caspase 3信號(hào)途徑有關(guān)。3、谷氨酸對(duì)PPARγ活性的調(diào)節(jié)作用:(1)p-PPARγ表達(dá):Western blot法檢測(cè)顯示,NMDA處理3-24h引起p-PPARγ表達(dá)呈時(shí)間依賴性增加。(2)PPARγ表達(dá):Western blot法檢測(cè)顯示,NMDA處理3、6 h PPARγ無(wú)明顯改變,12、24h PPARγ表達(dá)明顯增加。(3)p-PPARγ/PPARγ比值:NMDA處理引起比值呈雙相性改變,3-6h增加,12-24h下降(即恢復(fù)),提示NMDA通過誘導(dǎo)PPARγ磷酸化可引起PPARγ活性一過性抑制。(2)p-ERK1/2表達(dá):Western blot法檢測(cè)顯示,NMDA引起p-ERK1/2表達(dá)增加,作用呈時(shí)間及劑量依賴性(P0.05,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義),總ERK1/2無(wú)變化。(3 ERK1/2抑制劑U0126的作用:U0126可抑制NMDA引起p-ERK1/2、p-PPARγ表達(dá)增加,提示NMDA可通過激活ERK1/2引起PPARγ磷酸化。4、保護(hù)劑Ros、Pio、U0126對(duì)谷氨酸興奮毒性保護(hù)作用:(1)HE染色及TTC染色可見,與NMDA組相比,保護(hù)劑組損傷體積較NMDA組損傷體積明顯減小。(2)Western blot法檢測(cè)顯示,保護(hù)劑Ros、Pio、U0126可明顯抑制NMDA引起的COX-2、iNOS、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)增加(P0.05,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)。提示激活PPARγ或保護(hù)其活性對(duì)谷氨酸興奮毒性損傷具有保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)論:1、谷氨酸主要通過NMDA受體產(chǎn)生興奮毒性損傷作用2、谷氨酸損傷引起神經(jīng)元PPARγ的表達(dá)增加,該作用可能為NMDA受體依賴的、鈣離子-calpain-caspase-3介導(dǎo)的、與氧化應(yīng)激有關(guān)的一種神經(jīng)元自我保護(hù)性反應(yīng)。3、谷氨酸興奮毒性損傷早期通過增加PPARγ磷酸化修飾而引起一過性PPARγ活性抑制,該作用可能與谷氨酸激活MAPK/ERK1/2通路有關(guān)。4、PPARγ激動(dòng)劑(Ros、Pio)及ERK1/2激活抑制劑(U0126)對(duì)谷氨酸興奮毒性具有保護(hù)作用,其作用機(jī)制可能通過激活PPARγ或保護(hù)其活性,產(chǎn)生直接或間接的抗炎、抗氧化、抗凋亡等作用有關(guān)。
【學(xué)位單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R741
【部分圖文】：

天津醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文 度及不同時(shí)間組分別與對(duì)照組相比用單因素方差分析；U0126 處理組與正常組比較用獨(dú)立樣本 t 檢驗(yàn)，NMDA 組 與 U0126 不同濃間的比較用單因素方差分析。P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。果氨酸興奮毒性損傷評(píng)價(jià)1 大鼠大腦皮層微量注射預(yù)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)大鼠固定于立體定位儀上，予以亞甲藍(lán)染料 2μl 大腦皮層注射分布如圖所示（圖 1.1），注射的染料絕大部分部位位于單側(cè)左側(cè)大

圖 1.3 谷氨酸損傷對(duì)炎癥、凋亡蛋白 COX-2、iNOS、cleaved caspase-3 表達(dá)的影響(免疫熒光染色，×400)（3）腦組織 HE 染色HE 染色顯示（圖 1.4），與對(duì)照組相比，給予谷氨酸（200 mmol/L）處理 24h 后，低倍鏡（×10）下可見皮層有明顯損傷灶（淺色區(qū)域），高倍鏡（×200）下可見核固縮，胞質(zhì)濃縮，細(xì)胞體積減小，細(xì)胞排列紊亂等改變。

圖 1.3 谷氨酸損傷對(duì)炎癥、凋亡蛋白 COX-2、iNOS、cleav影響(免疫熒光染色，×400)（3）腦組織 HE 染色HE 染色顯示（圖 1.4），與對(duì)照組相比，給予谷氨酸（2h 后，低倍鏡（×10）下可見皮層有明顯損傷灶（淺色區(qū)域）下可見核固縮，胞質(zhì)濃縮，細(xì)胞體積減小，細(xì)胞排列紊亂等
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本文編號(hào)：2838408