背景:重癥肌無力(myasthenia gravis,MG)是一種自身免疫疾病,研究表明,其發(fā)生機(jī)制主要是機(jī)體產(chǎn)生針對神經(jīng)肌肉接頭(neuromuscular junctions,NMJs)相關(guān)蛋白的自身抗體。自身抗體針對的蛋白主要包括抗乙酰膽堿受體(acetylcholine receptor,AChR)、肌肉特異性激酶(muscle-specific kinase,MuSK)、脂蛋白相關(guān)蛋白4(lipoprotein receptor-related protein 4,Lrp4)以及集聚蛋白(agrin)等。其中抗AChR型重癥肌無力患者最為常見,約占總患者的80%,其次是抗MuSK型MG(MuSK-MG)。MuSK-MG發(fā)病機(jī)制主要是由于自身抗體與肌細(xì)胞上MuSK結(jié)合并阻礙其信號傳遞功能,抑制AChR聚集,導(dǎo)致神經(jīng)肌肉接頭終板電位減弱。目前臨床上的對癥治療對大多數(shù)抗AChR型重癥肌無力患者有較好的療效,但對MuSK-MG患者療效甚微。因此MuSK-MG也被稱為難治性重癥肌無力,成為臨床上治療的難題。腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus,AAV),作為目前廣泛利用的基因治療工具,能安全有效地運用于動物體。我們在本課題中檢驗了MuSK-MG患者血清中自身抗體的主要結(jié)合位點,并探索利用重組AAV在實驗性MuSK自身免疫性重癥肌無力(experimental autoimmune myasthenia gravis,EAMG)小鼠模型中進(jìn)行抗原特異性治療的可行性。目的:鑒定MuSK-MG患者抗體主要結(jié)合位點,構(gòu)建MuSK-EAMG小鼠模型,探索利用重組AAV進(jìn)行干預(yù)治療的可行性。方法:構(gòu)建MuSK胞外段重組載體并體外表達(dá)純化MuSK胞外段蛋白,利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測自身抗體的主要結(jié)合位點,免疫小鼠構(gòu)建MuSK-EAMG模型,并檢驗小鼠抗MuSK抗體滴度和行為學(xué)表現(xiàn),運用重組AAV探索對MuSK-EAMG的治療可行性。結(jié)果:(1)表達(dá)并純化MuSK胞外段蛋白;(2)利用ELISA技術(shù),在85例MG患者中,鑒定出22例抗MuSK抗體陽性,并發(fā)現(xiàn)這些患者中的自身抗體主要針對MuSK胞外段的Ig1結(jié)構(gòu)域;(3)使用純化的MuSK胞外段蛋白免疫小鼠,獲得MuSK-EAMG小鼠模型;(4)rAAV9型病毒可以高效感染小鼠骨骼肌。結(jié)論:我們鑒定發(fā)現(xiàn)約26%的MG患者血清中帶有抗MuSK抗體,抗體的主要結(jié)合位點為MuSK蛋白的Ig 1結(jié)構(gòu)域;利用AAV過表達(dá)Ig 1結(jié)構(gòu)域或?qū)?yīng)的多肽片段,可能特異性阻斷自身抗體與內(nèi)源蛋白的結(jié)合,從而對MuSK-MG進(jìn)行抗原特異性的治療。
【學(xué)位單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R746.1
【部分圖文】：

介導(dǎo)神經(jīng)肌肉接頭形成發(fā)育的分子機(jī)制

4 實驗結(jié)果4.1 構(gòu)建 MuSK 胞外段真核表達(dá)載體為了檢測重癥肌無力患者體內(nèi)是否有抗 MuSK 抗體，需要利用 M白檢測患者血清抗體與之結(jié)合的能力，因此我們構(gòu)建了 MuSK-ecto 體。主要目的有二：其一，利用 MuSK-ecto 蛋白檢測 MG 患者中 M概率，從而研究 MuSK-MG 抗體致病機(jī)制；其二，利用 MuSK-ecto鼠構(gòu)建 MuSK-EAMG 模型。MuSK-ecto 真核表達(dá)載體的構(gòu)建過程如圖 2。我們設(shè)計 SD 大鼠cDNA 上下游引物序列（具體操作見實驗方法），用分子克隆技術(shù)得到的 PCR 擴(kuò) 增 產(chǎn) 物 （ 圖 2B ） 。 再 將 目 的 片 段 連 接 到真 核pcDNA3.1-myc/HisA 中(圖 2A)。構(gòu)建得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 HEK293表達(dá)得到 MuSK-ecto 蛋白（2D）。A

圖 3：正常對照和重癥肌無力患者血清抗 MuSK 抗體檢測（A）正常對照和 85 位重癥肌無力患者血清抗 MuSK 抗體 ELISA 檢測結(jié)果；（B）M陰性和 MuSK 陽性 MG 患者 ELISA 檢測結(jié)果。所檢測的重癥肌無力患者中有 22 例表MuSK 陽性。4.2.1 MuSK 胞外段各結(jié)構(gòu)域的表達(dá)研究表明 MuSK-MG 患者體內(nèi)的自身抗體主要與神經(jīng)肌肉接頭突觸后MuSK 的胞外段結(jié)合[28]。MuSK 蛋白為單次跨膜蛋白，具有胞外段和胞內(nèi)段中胞內(nèi)段具有酪氨酸激酶活性，負(fù)責(zé)激活下游信號傳導(dǎo)。而胞外段是 MuSKLrp4 蛋白的主要結(jié)合位點，是接受 agrin-Lrp4 信號傳遞的主要區(qū)域。根據(jù)蛋一級結(jié)構(gòu)，MuSK 胞外段可分為 4 個結(jié)構(gòu)域（圖 4A），包括 3 個類似免疫白的結(jié)構(gòu)域（簡稱為 Ig1、Ig2、Ig3），以及一個半胱氨酸富集區(qū)（cystine richdomCRD 或 Frizzled 結(jié)構(gòu)域，F(xiàn)Z）[29]。

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本文編號：2817011