【摘要】：目的:惡性膠質(zhì)瘤是人腦最常見的惡性腫瘤,但目前無論手術(shù)治療還是放化療,治療效果都不是很理想,因此基因治療方案越來越受學(xué)者們關(guān)注。單純皰疹病毒胸苷激酶/丙氧鳥苷(HSVtk/GCV,herpes simplex virus thymidine kinase/ganciclovir)腫瘤自殺基因治療系統(tǒng)具有顯著的殺傷腫瘤作用,但由于單純皰疹病毒胸苷激酶(HSVtk)基因在體轉(zhuǎn)導(dǎo)效率很低,而利用體外導(dǎo)入HSVtk基因又一直沒有找到合適的載體細(xì)胞,因此直接阻礙了該治療方案在臨床上的進(jìn)一步應(yīng)用。近年來,有研究表明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有在基因治療中攜帶和運(yùn)送治療基因的能力,而且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了攜帶了HSVtk基因的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC-tk)與不同種系的膠質(zhì)瘤細(xì)胞之間存在著較好的旁觀者效應(yīng)。本研究旨在進(jìn)一步探討TK骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC-tk)的體外抗腫瘤作用。方法:C6(大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞)的培養(yǎng)。原代BMSC(大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞)的提取,形態(tài)學(xué)鑒定及培養(yǎng)。Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證BMSC向C6的定向遷移能力。pEX-4-herpesvirus進(jìn)行外源性HSVtk基因?qū)6和BMSC細(xì)胞轉(zhuǎn)染,并觀察兩種細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。細(xì)胞增殖測(cè)試實(shí)驗(yàn)(Cell counting kit-8,CCK-8)法檢測(cè)C6-tk(TK大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞)及BMSC-tk細(xì)胞對(duì)GCV的體外敏感性。C6與BMSC-tk共培養(yǎng)在不同濃度(0~100ug/ml)GCV(更昔洛韋)的條件培養(yǎng)液,用CCK-8分析法檢測(cè)存活的細(xì)胞數(shù)量來評(píng)價(jià)其抗腫瘤活性。結(jié)果:培養(yǎng)過C6細(xì)胞的條件培養(yǎng)基組的穿膜細(xì)胞數(shù)顯著高于Control(新鮮培養(yǎng)基)組(P0.001)。C6的轉(zhuǎn)染效率超過20%,而BMSC的轉(zhuǎn)染效率還不到10%,且熒光強(qiáng)度較弱。C6-tk及BMSC-tk的細(xì)胞存活率隨GCV濃度增大均出現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì);與Control組相比,GCV濃度大于0.1ug/ml時(shí)C6-tk的細(xì)胞存活率開始下降,而BMSC-tk細(xì)胞是當(dāng)GCV濃度大于0.3ug/ml時(shí)開始下降;當(dāng)GCV濃度增至10ug/ml時(shí)C6-tk和BMSC-tk細(xì)胞的存活率下降均最為顯著(P0.001),而繼續(xù)增大GCV濃度,細(xì)胞存活率都再無顯著下降(P0.05)。GCV濃度為1、3、10、30、100ug/ml時(shí)BMSC-tk+C6的細(xì)胞存活率均有顯著下降(P0.05、P0.01、P0.001、P0.001、P0.001)。其中10ug/ml組BMSC-tk+C6的細(xì)胞存活率下降最為顯著,而繼續(xù)提高GCV的濃度后BMSC-tk+C6的細(xì)胞存活率較10ug/ml組不再明顯下降。在GCV濃度為10ug/ml時(shí)BMSC-tk細(xì)胞與BMSC-NC細(xì)胞相比下降的OD值顯著低于BMSC-tk+C6細(xì)胞與BMSC-NC+C6細(xì)胞相比下降的OD值(P0.001)。結(jié)論:1.BMSC對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞具有明顯的定向遷移能力。2.C6-tk細(xì)胞在體外條件下對(duì)GCV有顯著的敏感性,且敏感性最為顯著時(shí)的最低GCV濃度為10ug/ml;3.BMSC-tk細(xì)胞在體外條件下對(duì)GCV有顯著的敏感性,且敏感性最為顯著時(shí)的最低GCV濃度為10ug/ml;4.BMSC-tk在體外條件下對(duì)C6細(xì)胞存在明顯的殺傷作用,且殺傷作用達(dá)到最大時(shí)的最低GCV濃度為10ug/ml;
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R739.41
【圖文】：

中國(guó)醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文3 結(jié)果3.1 原代大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的提取剛接種的 BMSC 體積很小，呈圓形（圖 1A ）。 第 3 天胞貼壁，體積仍較小，形態(tài)多樣，大部分細(xì)胞形態(tài)呈橢圓形、伸出長(zhǎng)短不一、粗細(xì)不等的胞質(zhì)突起互相連接（圖 1B ）。 7 天形成大小不一的細(xì)胞集落，細(xì)胞數(shù)量明顯增多，體積增大，以狀向四周擴(kuò)展（圖 1C ）。 傳代后細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，呈長(zhǎng)梭形、形態(tài)均一，趨向一致（圖 1D）。

圖 2 BMSC 對(duì) C6 細(xì)胞定向遷移能力的測(cè)定，Control 代表新鮮培養(yǎng)基組，conditioned medium代表培養(yǎng)過 C6 細(xì)胞的條件培養(yǎng)基組。A：小室下為不同培養(yǎng)基時(shí) BMSC 通過 transwell 小室人工基膜的基底層后染色，在顯微鏡下的圖片，a 代表小室下為新鮮培養(yǎng)基時(shí) BMSC 遷移后染色，顯微鏡下的圖片；b 代表小室下為培養(yǎng)過 C6 細(xì)胞的培養(yǎng)基時(shí)，BMSC 遷移后染色，顯微鏡下的圖片。B：BMSC 在不同培養(yǎng)基下遷移通過基膜的細(xì)胞數(shù)的統(tǒng)計(jì)圖，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示（n=5），conditioned medium 組與 Control 組相比存在顯著差異以*** P <0.001 表示。3.3 C6 和 BMSC 導(dǎo)入 HSV-tk 的轉(zhuǎn)染效率C6 細(xì)胞和 BMSC 細(xì)胞均導(dǎo)入空載質(zhì)粒（ex-NC）和 TK 質(zhì)粒（ex-TK），轉(zhuǎn)染后48 小時(shí)分別在顯微鏡的同一視野計(jì)數(shù)各自在熒光下帶有熒光標(biāo)記的細(xì)胞數(shù)和在正常光源下的細(xì)胞數(shù)，根據(jù)兩者的比值計(jì)算出各自的轉(zhuǎn)染效率，每種細(xì)胞隨機(jī)選取 5個(gè)視野計(jì)數(shù)。如圖 3A 所示：C6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后在熒光下觀察帶光的細(xì)胞數(shù)比 BMSC

圖 3 C6 細(xì)胞和 BMSC 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。A：C6 細(xì)胞和 BMSC 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 ex-NC（空載質(zhì)粒）和ex-TK（TK 質(zhì)粒）后在熒光下的圖片，a 代表 C6 轉(zhuǎn)染 ex-NC 的圖片；b 代表 C6 轉(zhuǎn)染 ex-TK 的圖片；c 代表 BMSC 轉(zhuǎn)染 ex-NC 的圖片；d 代表 BMSC 轉(zhuǎn)染 ex-TK 的圖片。 B：兩種細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的統(tǒng)計(jì)圖，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示（n=5），BMSC ex-NC 組與 C6 ex-NC 組相比存在顯著差異以***P<0.001 表示；BMSC ex-TK組與 C6 ex-TK 組相比存在顯著差異以***P<0.001 表示。3.4 C6-tk 細(xì)胞對(duì) GCV 的體外敏感性CCK-8 分析法測(cè)定細(xì)胞存活率。如圖 4A 所示，Control 組及 ex-NC 組隨 GCV濃度的增大細(xì)胞存活率無明顯下降，而 ex-TK 組的細(xì)胞存活率隨 GCV 濃度增大出現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì)。與 Control 組相比，GCV 濃度大于 0.1ug/ml 時(shí) ex-TK 組的細(xì)胞存活率開始下降，當(dāng) GCV 濃度增至 10ug/ml 時(shí)細(xì)胞的存活率下降最為顯著（P<0.001），而繼續(xù)增大 GCV 濃度，細(xì)胞存活率再無顯著下降（P>0.05）。如圖 4B，C，D 所示：GCV 濃度為 0.3、1、10μg/ml 時(shí)，ex-TK 組的細(xì)胞存活率與 Control

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 燕學(xué)波;杜運(yùn)華;呂安林;邢玉潔;胡朝暉;胡新君;岳峰;;大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定[J];實(shí)用醫(yī)藥雜志;2012年10期

本文編號(hào)：2797020