發(fā)布時間：2021-10-26 00:30

　　研究背景與目的:成人生長激素缺乏癥是由垂體前葉分泌生長激素不足引起的內分泌疾病,常伴有身體成分組成比例改變,脂糖代謝紊亂,導致非酒精性脂肪肝發(fā)病率明顯高于正常人。我們既往研究表明,生長激素缺乏條件下棕櫚酸（PA）可以加重肝細胞的脂質沉積,本研究中,我們探討生長激素缺乏狀態(tài)下棕櫚酸（PA）增加線粒體氧化應激加重肝細胞凋亡的經典信號通路。方法:構建慢病毒干擾載體下調永生化肝L02細胞生長激素受體（GHR）,PCR法檢測GHR的mRNA表達水平,構建穩(wěn)定低表達GHR的肝L02細胞株。用不同濃度PA（75umol,150umol或300umol）處理肝L02細胞12h,24h,48h,檢測細胞活力以篩選最適宜處理條件。將實驗分為慢病毒GHR敲低組（shRNAGHR）和空載病毒（Vector）組,使用PA（150umol）干預細胞24h。采用油紅“O”,BODIPY熒光染色觀察生長激素缺乏的L02肝細胞與對照肝細胞內脂質沉積情況;流式細胞儀檢測細胞凋亡情況;JC-1檢測L02肝細胞內線粒體膜電位的變化;DHE熒光探針檢測細胞ROS水平以及MitoSox熒光探針檢測線粒體ROS水平,western... 

【文章來源】：重慶醫(yī)科大學重慶市

【文章頁數】：42 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

PA對正常肝L02細胞活力的影響

重慶醫(yī)科大學碩士研究生學位論文16義鏈分別為:5’-TACAATAAGGTATCCAGATGG-3’。本研究驗證該序列持續(xù)有效。如圖2所示，轉染慢病毒后用PCR技術檢測肝L02細胞GHR的mRNA水平，結果表明生長激素受體基因敲低大于70%，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01），提示低表達生長激素受體的肝細胞模型建立成功。圖2：重組慢病毒轉染L02細胞抑制GHR表達Fig.2TheefficiencyofLenti-GHRvirustransfectedinL02cell.**meansP<0.012.3敲低GHR對凋亡及ROS的影響凋亡是細胞為維持內環(huán)境穩(wěn)定出現的自發(fā)性的死亡過程，是一種主動、高度有序、基因控制、信號依賴以及一系列酶參與的過程，在非酒精性脂肪肝的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。氧化應激反應是ROS產生與清除的失調，在細胞內堆積過多，活性氧自由基可以與多不飽和脂肪酸過氧化反應生成過氧化脂質，該過程會導致一系列毒性作用包括細胞內蛋白以及酶變形，DNA氧化修飾，生物膜脂質過氧化，增加細胞對外界刺激的敏感性，從而導致肝細胞更容易發(fā)生凋亡。為了探討敲低GHR對細胞ROS以及凋亡的影響，本研究采用150uMPA處理敲低GHR組與對照Vector組肝L02細胞，在12h，24h和48h檢測細胞凋亡水平和ROS水平。本研究用annexvFITC-PI流式細胞術檢測凋亡，DHE熒光探針檢測細胞內ROS水平。如圖3a提示GHR敲低組在12h，24h以及48h的每個時間點凋亡細胞數目均高于對照組，圖3b提示GHR敲低組在12h，24h以及48h的每個時間點ROS水平均高于正常對照組，圖3c為量化的細胞凋亡水平，圖3d量化的細胞ROS水平，差異有統(tǒng)計學意義。*P<0.05,**P<0.01

重慶醫(yī)科大學碩士研究生學位論文182.4敲低GHR加重肝細胞脂肪沉積圖4油紅以及BODIPY觀察脂質沉積情況Figure4EffectofknockdownGHRonleveloflipiddepositionlevelinPAhepatocyte脂質沉積是細胞凋亡的重要因素，也是細胞發(fā)生凋亡的早期特征。本研究通過油紅“O”以及BODIPY熒光染色檢測肝細胞脂質沉積情況。將敲低組和Vector組細胞種于爬片，用150uM的PA干預細胞24小時。給予PA刺激后GHR敲低組與Vector組相比，肝細胞內油紅顆粒聚集更加明顯，BODIPY胞質內熒光染色脂質顆粒更豐富，提示PA干預敲低GHR的肝細胞更容易發(fā)生脂質沉積。2.5敲低GHR對線粒體膜電位，線粒體內ROS以及ATP的影響線粒體正常的膜電位維持了線粒體正常的功能，線粒體膜電位的去極化代表了線粒體凋亡的早期發(fā)生。為了觀察敲低GHR對線粒體凋亡以及線粒體ROS的影響，用150uM的PA干預細胞24小時，圖4a證實了敲低GHR的肝細胞給予PA刺激后JC-1染色復合體與單體紅綠光比率明顯下降，提示膜電位去極化損傷更加嚴重，是發(fā)生細胞凋亡早期特征；線粒體內ROS是細胞呼吸的副產品，過量的ROS產生直接會導致線粒體結構功能的損傷，線粒體損傷會導致ROS消耗進一步減少，ATP合成進一步降低，導致細胞進一步損傷直至凋亡。圖4b使用特異性線粒體ROS檢測試劑mitoSox特異性熒光探針，表明與Vector組相比，敲低GHR組PA干預細胞后線粒體內ROS明顯增加。使用ATP化學發(fā)光檢測試劑盒證實，敲低GHR組與Vector組相比，PA干預細胞后ATP水平明顯更低，證實了線粒體功能受損，利用ROS產生ATP的能力下降，細胞內氧自由基清除能力受損，如圖4c，差異均有統(tǒng)計學意義。*P<0.05,**p<0.01

【參考文獻】：
期刊論文
[1]Nonalcoholic fatty liver disease and mitochondrial dysfunction[J]. R Scott Rector,John P Thyfault,Jamal A Ibdah.  World Journal of Gastroenterology. 2008(02)



本文編號：3458469