骨質(zhì)疏松癥被世界衛(wèi)生組織(WHO)評為第二大危害人類健康的疾病,僅次于心血管疾病。我國隨著改革開放帶來的高度城市化、人口老齡化進程的不斷加快和不健康生活方式的廣泛流行,骨質(zhì)疏松癥的患病率日漸升高。據(jù)2018年10月國家衛(wèi)生健康委員會和疾病預(yù)防控制中心發(fā)布的最新骨質(zhì)疏松癥流行病學調(diào)查結(jié)果表明:骨質(zhì)疏松癥在50歲以上人群中的患病率為19.2%,65歲以上為32.0%,其中女性患病率高達51.6%。骨質(zhì)疏松癥引起的脆性骨折嚴重降低了患者的生活質(zhì)量,老年患者髖部骨折后1年內(nèi)的死亡率高達20%,給家庭和社會帶來了沉重的經(jīng)濟負擔。因此,重視骨質(zhì)疏松癥的防治,防止骨折的發(fā)生具有重要的社會意義。破骨細胞(Osteoclast,OC)和成骨細胞(Osteoblast,OB)在穩(wěn)定的骨重建及骨代謝過程中發(fā)揮著重要的作用。破骨細胞的分化依賴細胞核因子κB受體活化因子配體(Receptor Activator of Nuclear factor Kappa B Ligands,RANKL)和破骨細胞前體細胞膜的細胞核因子κB受體活化因子(Receptor Activator of Nuclear factor Kappa B,RANK)的相互作用,并受多種信號途徑和轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)。首先,轉(zhuǎn)錄因子PU.1[Spleen focus-forming virus(SFFV)proviral integration 1]與NFATc1啟動子直接結(jié)合,使NFATc1表達增加,并促進破骨細胞前體細胞的發(fā)育。其次,RANKL通過介導下游信號分子核轉(zhuǎn)錄因子kappa B(NF-κB)、c-Jun、活化T細胞核因子c1(NFATc1)以及p38/c-Fos(Cellular oncogene fos)的表達,調(diào)控破骨細胞的分化。在此過程中,破骨細胞前體細胞(Osteoclast precursor cells,OCPs)之間的融合是多核破骨細胞生成的必要條件,而樹突狀細胞特異性跨膜蛋白(Dendritic cell-specific transmembrane protein,DC-STAMP)及空泡型質(zhì)子泵(H+-ATP酶)是介導細胞融合的重要因素。目前,治療骨質(zhì)疏松的藥物仍以雙膦酸鹽類為代表性藥物的骨吸收抑制劑為主,然而長期治療存在價格較高、患者依從性差、口服制劑消化道黏膜副作用大、靜脈制劑可引起下頜骨壞死及非典型骨折等問題。此外隨著研究的不斷深入,還有許多作用于破骨細胞的藥物將在未來應(yīng)用于骨質(zhì)疏松患者的治療,如抗RANKL單克隆抗體、C-src激酶抑制劑及組織蛋白酶K抑制劑等。Niclosamide(氯硝柳胺)是WHO推薦的一種滅螺藥。近年來,研究發(fā)現(xiàn)它可作用于Wnt、NF-κB、Notch及STAT-3等多種細胞通路,干擾細胞代謝,影響細胞生長甚至誘導細胞死亡;還可通過抑制c-Fos、c-jun及c-Myc等,降低脂多糖誘導的樹突狀細胞的成熟及多種細胞因子的表達,抑制骨肉瘤細胞的增殖。上述通路和細胞因子同樣涉及破骨細胞的分化及骨吸收過程,有研究報道Niclosamide作為ATPase抑制劑可通過抑制破骨細胞泌酸來減少骨吸收。Niclosamide在應(yīng)用于其他疾病時有別于滅螺,為提高其在體內(nèi)的生物利用度,近年來也在不斷改進化學結(jié)構(gòu),其中DK-520是Niclosamide的�；苌�,在體內(nèi)代謝成Niclosamide,通過結(jié)構(gòu)的變化可提高口服血藥濃度及生物利用度并延長暴露時間。該課題通過研究Niclosamide和DK-520對破骨細胞分化過程的影響及對調(diào)控破骨細胞早期融合及分化過程中的主要因子PU.1、DC-STAMP及ATPaseV_0d_2表達的影響,明確Niclosamide和DK-520抑制破骨細胞的主要分子機制,期望對骨質(zhì)疏松癥的臨床治療提供新的方向,達到“老藥新用”的目的。一、RANKL和M-CSF誘導破骨細胞分化成熟目的:利用RANKL和M-CSF將小鼠骨髓源性的單核/巨噬細胞誘導為破骨細胞并予以鑒定,為體外研究破骨細胞的分化和功能提供研究基礎(chǔ)。方法:取4-8周齡的C57BL/6小鼠,分離脛骨與股骨,提取單核/巨噬細胞,利用RANKL和M-CSF誘導分化,通過抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色觀察細胞形態(tài),RT-PCR檢測破骨細胞表型基因,對誘導形成的破骨細胞予以鑒定。結(jié)果:TRAP染色結(jié)果顯示陽性的多核細胞出現(xiàn),RT-PCR結(jié)果表明有破骨細胞表型基因的表達。結(jié)論:從C57BL/6小鼠股骨與脛骨中提取的骨髓單核/巨噬細胞可在RANKL和M-CSF誘導下產(chǎn)生破骨細胞。二、Niclosamide和DK-520對RANKL誘導的破骨細胞分化的影響目的:該部分提取骨髓源性的單核/巨噬細胞,以RANKL和M-CSF誘導培養(yǎng)OC,給與不同濃度Niclosamide和DK-520干預(yù),評價兩種藥物對TRAP陽性多核破骨細胞分化的影響。方法:首先采用CCK-8檢測藥物劑量毒性,選取合適的藥物濃度進行后續(xù)實驗。按干預(yù)藥物的種類及濃度分5組:DMSO對照組、Niclosamide 0.75μM組、Niclosamide1.5μM組、DK-520 0.75μM組及DK-520 1.5μM組。為明確Niclosamide和DK-520的藥物作用發(fā)生在破骨細胞分化的時間周期,以0-1天,1-2天,2-3天,3-4天的不同時間點分別給藥處理。培養(yǎng)3天后,分別對各干預(yù)組與DMSO對照組細胞進行TRAP染色并計數(shù),比較干預(yù)組和對照組間OC數(shù)量與大小的差異。結(jié)果:與對照組相比,干預(yù)組TRAP染色陽性的破骨細胞形成明顯減少(p0.05),且具有體積小、多核細胞少的特征,并與藥物濃度呈劑量依賴性關(guān)系;不同時間點給藥處理后的結(jié)果顯示,TRAP陽性破骨細胞在早期階段數(shù)量即明顯減少(p0.05)。結(jié)論:Niclosamide和DK-520劑量依賴性抑制破骨細胞的生成,其作用發(fā)生在破骨細胞分化的早期階段。三、Niclosamide和DK-520對RANKL誘導的PU.1,DC-STAMP及ATPaseV_0d_2表達的影響目的:擬通過檢測RANKL誘導的OCPs向成熟破骨細胞分化過程中PU.1,DC-STAMP及ATPaseV_0d_2的表達水平,探討Niclosamide和DK-520影響破骨細胞分化的具體分子機制。方法:按干預(yù)藥物的種類及濃度將培養(yǎng)細胞分為:DMSO對照組、Niclosamide 0.75μM組、Niclosamide 1.5μM組、DK-520 0.75μM組及DK-520 1.5μM組,并按不同時間點分別給藥處理。按1×10~5/孔濃度將骨髓單核/巨噬細胞接種于6孔板中,培養(yǎng)2-3天,分別在0-1天和1-2天時加入RANKL、M-CSF以及藥物干預(yù)處理,繼續(xù)培養(yǎng)24小時,利用RT-PCR及Western Blot,檢測PU.1、DC-STAMP與ATPaseV_0d_2的表達水平。結(jié)果:實時熒光定量PCR結(jié)果表明,在0-1天和1-2天,不同濃度Niclosamide及DK-520組PU.1基因表達水平均較對照組明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05);Western Blot結(jié)果表明,各干預(yù)組的DC-STAMP蛋白表達水平均較對照組降低(p0.05);干預(yù)組與對照組中ATPaseV_0d_2的表達水平無明顯差異(p0.05)。結(jié)論:Niclosamide和DK-520可抑制破骨細胞早期分化階段轉(zhuǎn)錄因子PU.1與OCPs融合介導因子DC-STAMP的表達,從而抑制破骨細胞的分化。
【學位單位】：山西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R580
【部分圖文】：

圖 1：破骨細胞的鑒定注：A:倒置相差顯微鏡下 TRAP 染色觀察（40×）；B:破骨細胞表型基因 TRAP、RANK 及 CtK mRNA 的表達水平（**p<0.001,#p<0.01）。3 結(jié) 論從 C57/BL6 小鼠體內(nèi)提取單核/巨噬細胞，加入 M-CSF 和 RANKL 誘導培養(yǎng) 3-天后，TRAP 染色鑒定有破骨細胞生成，并可檢測到 RANK、TRAP、CatK 等破骨細胞表型基因標志物的表達。4 討 論破骨細胞是一種終末分化細胞，在骨吸收中起重要作用[7]。成熟破骨細胞的形成

山西醫(yī)科大學碩士學位論文2.2 CCK-8 實驗結(jié)果CCK-8 檢測細胞增殖與藥物毒性發(fā)現(xiàn)，Niclosamide 在濃度小于 1.75μM 時，各組間無明顯差異，各藥物濃度對破骨細胞前體細胞均無明顯的毒性作用；DK-520 在濃度小于 2μM 時對破骨細胞前體細胞無明顯毒性作用。在由 M-CSF 和RANKL誘導 3天后的成熟破骨細胞中分別加入 DMSO 及不同濃度的 Niclosamide和 DK-520 培養(yǎng) 24 小時后檢測，各組間無明顯差異。在 CCK-8 藥物毒性檢測的基礎(chǔ)上，選取 Niclosamide 和 DK-520 0.75μM 和 1.5μM 進行后續(xù)實驗（圖 2）。

圖 3： 不同濃度 Niclosamide 和 DK-520 抑制破骨細胞分化注：（A）培養(yǎng)板中細胞 TRAP 染色觀察；（B）倒置相差顯微鏡下不同濃度 Niclosamide 干預(yù) 24 小時后細形態(tài)（40×）；（C）倒置相差顯微鏡下不同濃度 Niclosamide 干預(yù) 24 小時后細胞數(shù)量；（D）倒置相差顯微鏡下同濃度 DK-520 干預(yù) 24 小時后細胞形態(tài)（40×）；（E）倒置相差顯微鏡下不同濃度 DK-520 干預(yù) 24 小時后細胞量（**p<0.001）。（2）按不同時間點即 0-1、1-2、2-3、3-4 天分別給藥處理后，與 DMSO 對照組相比TRAP 陽性的破骨細胞數(shù)量減少，體積變小，且在早期階段差異最顯著（圖 4）。

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本文編號：2825739