【摘要】：目的1.明確2012.1-2013.12上海地區(qū)諾如病毒在成人中的分子流行病學(xué)特點(diǎn)。2.構(gòu)建GII.4流行株體外分子進(jìn)化模型,系統(tǒng)把握GII.4流行株進(jìn)化趨勢(shì),同時(shí)篩選關(guān)鍵信息位點(diǎn)。3.明確國(guó)內(nèi)近期GII.4流行株Den_Haag_2006b、New_Orleans_2009及Sydney_2012的受體識(shí)別模式,同時(shí)評(píng)估三種流行株的抗原性,從受體結(jié)合功能及抗原性漂變兩個(gè)方面初步探討近期GII.4流行株的進(jìn)化規(guī)律。方法1.上海地區(qū)成人諾如病毒的分子流行病學(xué)調(diào)查收集上海市兩處哨點(diǎn)醫(yī)院(長(zhǎng)寧區(qū)中心醫(yī)院和同濟(jì)大學(xué)附屬上海東方醫(yī)院)成人(≥16歲)急性腹瀉患者的糞便樣本,同時(shí)系統(tǒng)搜集患者的臨床信息。采用多重逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)進(jìn)行諾如病毒的常規(guī)檢測(cè),陽(yáng)性樣本PCR產(chǎn)物直接外送測(cè)序并進(jìn)行基因分型。2.GII.4流行株體外分子進(jìn)化模擬研究以Camberwell_1994為原型株,收集1995年以來的GII.4流行株(US95_96、 Farmington_Hills_2002、Hunter_2004、Den_Haag_2006b、New_Orleans_2009 及 Sydney_2012)主要衣殼蛋白VPl基因序列全長(zhǎng),通過多序列聯(lián)配進(jìn)行位點(diǎn)變異分析,并采用系統(tǒng)發(fā)育分析確定流行株的進(jìn)化趨勢(shì),同時(shí)利用正向選擇分析篩選關(guān)鍵信息位點(diǎn),構(gòu)建GII.4流行株體外分子進(jìn)化模型。3.GII.4流行株進(jìn)化規(guī)律的初步研究以近期Den_Haag_2006b、New_Orleans_2009及Sydney_2012三種流行株為主要研究對(duì)象,分別構(gòu)建pET-42a(+)AP1重組表達(dá)載體,采用Rosetta(DE3)原核表達(dá)體系進(jìn)行體外蛋白表達(dá)和純化。首先評(píng)估三種流行株VP1蛋白與ABO血型組織抗原的親和力,其次采用流行株感染患者恢復(fù)期血清和健康成人血清,通過交叉反應(yīng)及受體親和抑制試驗(yàn),從受體識(shí)別模式及抗原性漂變兩個(gè)方向探討GII.4流行株的進(jìn)化規(guī)律。結(jié)果1.上海地區(qū)成人諾如病毒的分子流行病學(xué)調(diào)查2012年1月至2013年12月,共采集846份成人(≥16歲)急性腹瀉患者糞便樣本,其中2012年度387份,2013年度459份,全部樣本均完成常規(guī)分子檢測(cè)。GI群檢出22例,檢出率為2.60%；GII群檢出117例,檢出率13.83%。GI群呈現(xiàn)低位流行、全年散發(fā)的狀態(tài),無明顯的季節(jié)分布；GII群在2012年10月-12月出現(xiàn)高位流行,檢出率均在30%以上,11月份的檢出率高達(dá)60%。同時(shí)發(fā)現(xiàn),GII群諾如病毒相關(guān)的急性腹瀉好發(fā)于中老年人,特別是46-55歲個(gè)體,檢出率達(dá)20.30%,相比于35歲以下個(gè)體,46歲以上人群GII群檢出率明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。GI群在成人中的流行無明顯年齡分布特征。對(duì)諾如病毒陽(yáng)性樣本進(jìn)行基因分型發(fā)現(xiàn),近兩年來上海地區(qū)GI群主要的流行株為GI.3和GI.4。GII群中絕大部分為GII.4型,占93.40%,除既往Den Haag_2006b及New Orleans_2009流行株外,首次檢測(cè)到新型變異株Sydney_2012。同時(shí)發(fā)現(xiàn),2012年10-12月在上海地區(qū)高位流行的GII群均是該新型GII.4變異株,表明其已成為上海地區(qū)的優(yōu)勢(shì)株�；仡櫡治霭l(fā)現(xiàn),Sydney_2012新型變異株在2012年9月份已經(jīng)在上海地區(qū)出現(xiàn)。進(jìn)一步分析證實(shí)Sydney_2012變異株為GII.e型ORF1與GII.4型ORF2的重組體,重組位點(diǎn)處于基因組5037bp-5062bpo2.GII.4流行株體外分子進(jìn)化模擬的研究通過對(duì)188條VPI全長(zhǎng)序列的比對(duì)分析,共檢出57處變異頻繁的氨基酸位點(diǎn),其中40個(gè)突變位點(diǎn)集中在P2區(qū),不同時(shí)期的流行株也出現(xiàn)重復(fù)使用相同氨基酸殘基的現(xiàn)象。對(duì)VP1全長(zhǎng)序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示,不同時(shí)期的流行株存在一定的進(jìn)化距離,在進(jìn)化樹中以單一的簇存在。對(duì)VP1不同區(qū)域分別進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn),僅P2區(qū)的進(jìn)化趨勢(shì)與VP1全長(zhǎng)基因高度一致,而S區(qū)和P1區(qū)的進(jìn)化分析顯示各個(gè)時(shí)期流行株交錯(cuò)分布,無法表征不同時(shí)期流行株間的分子進(jìn)化距離。正向選擇分析共檢出13處關(guān)鍵信息位點(diǎn),其中9處集中于P2區(qū)。3.GII.4流行株進(jìn)化規(guī)律的初步研究通過體外蛋白表達(dá)對(duì)近期Den_Haag_2006b、New_Orleans_2009及Sydney_2012三種流行株的受體識(shí)別模式鑒定發(fā)現(xiàn),三種流行株對(duì)不同型別的ABO組織血型抗原均顯示出較高的親和活性,表明近期流行株表現(xiàn)出受體親和的廣嗜性。采用健康成人及流行株感染恢復(fù)期血清行抗原抗體交叉反應(yīng)發(fā)現(xiàn),健康人群中超過80%為抗諾如病毒IgG抗體陽(yáng)性,人群中普遍存在一定滴度的抗GII.4流行株IgG抗體。雖然Den_Haag_2006b和Sydney_2012流行株感染者恢復(fù)期抗血清與不同時(shí)期流行株均有較強(qiáng)的交叉反應(yīng),但二者均可特異性屏蔽同時(shí)期流行株衣殼蛋白與HBGA受體的親和活性,對(duì)其他時(shí)期流行株則無顯著的屏蔽作用。而健康成人血清對(duì)近期GII.4流行株的受體親和活性也無明顯抑制作用。結(jié)果提示GII.4流行株進(jìn)化過程中出現(xiàn)抗原性漂變以逃避群體的保護(hù)性免疫,但簡(jiǎn)單的交叉反應(yīng)無法分辨,須進(jìn)行受體親和抑制試驗(yàn)以鑒定功能性中和抗體。結(jié)論1.諾如病毒GII.4流行株呈現(xiàn)出周期性流行的特點(diǎn),現(xiàn)階段Sydeny_2012已取代Den_Haag_2006b和New Orleans 2009成為上海地區(qū)的優(yōu)勢(shì)流行株。2.P2區(qū)是GII.4流行株VP1蛋白分子進(jìn)化的關(guān)鍵區(qū)域,進(jìn)化趨勢(shì)與VP1全長(zhǎng)基因高度一致,受基因組空間的限制,GII.4流行株VPl序列中的位點(diǎn)變異主要集中在P2區(qū),單位點(diǎn)的變異可能同時(shí)影響流行株的受體親和及VP1蛋白的抗原性。3.近期GII.4流行株呈現(xiàn)出受體親和的廣嗜性,三種流行株均可感染較大規(guī)模的宿主人群且結(jié)合ABO組織血型抗原受體的種類并未發(fā)生顯著性改變,但抗原性漂變持續(xù)存在,提示抗原性漂變可能是近期流行株在人群中大規(guī)模播散流行的最主要原因。
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R512.5;R181.3
【圖文】：

群檢出１１７例，檢出率１３．８３％。ＧＩ群呈現(xiàn)低位流行、全年散發(fā)的狀態(tài)，無明顯逡逑的季節(jié)分布；ＧＩＩ群在２０１２年１０月－１２月出現(xiàn)高位流行，檢出率均在３０％邋Ｗ上，逡逑１１月份的檢出率一度商達(dá)６０％邋（圖１．１）。逡逑１３逡逑

圖３．１邋ｐＥＴ－４２ａ（＋）質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖逡逑采用ＢａｍＨ邋Ｉ和Ｈｉｎｄ邋ＩＩＩ雙酶切質(zhì)粒ｐＧＭ－Ｔ／ＶＰｌ和ｐＥＴ－４２ａ（＋），反應(yīng)體系如逡逑下：逡逑ＢａｍＨ邋１（１５Ｕ／陽(yáng)邐叫逡逑Ｈｉｎｄ邋ＩＩＩ邋（１５１１／陽(yáng)邐１邋叫逡逑載體（８０ｎｇ／叫）邐１２＾１１逡逑ｌ0ｘＫ邋Ｂｕｆｆｅｒ邐２邋山逡逑加去離子水至邐２０叫逡逑酶切反應(yīng)在３７°Ｃ進(jìn)行，溫育２ｈ。反應(yīng)結(jié)束后，將酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠逡逑電泳，并從凝膠中回收酶切后的ＤＮＡ，操作步歘如前所述。逡逑２．２．３連接反應(yīng)逡逑采用紫外分光光度計(jì)分別確定切膠回收后的ＶＰ１目的片段及ｐＥＴ－４２ａ（＋）載體逡逑濃度，按下列反應(yīng)體系進(jìn)行：逡逑

【共引文獻(xiàn)】

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 戴迎春;基于P顆粒的諾如病毒GII.4型流行株進(jìn)化機(jī)制及免疫保護(hù)研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2013年

本文編號(hào)：2728448