發(fā)布時(shí)間：2020-11-10 02:20

　　 目的：了解天津市麻疹病毒(measles virus,MV)流行株的基因型并在本實(shí)驗(yàn)室建立分子病毒學(xué)的研究方法。方法：將2002年天津市的麻疹散發(fā)病人尿液標(biāo)本中分離到的麻疹病毒12株用EB病毒轉(zhuǎn)化的絨猴淋巴細(xì)胞(B95a細(xì)胞)復(fù)蘇后，提取其總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈反應(yīng)(RT—PCR)方法擴(kuò)增出核蛋白(N)基因碳末端590個(gè)核苷酸片段，用BcnⅠ內(nèi)限酶進(jìn)行限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(RFLP)后，選取了3株與PMD-18T Vector構(gòu)建重組質(zhì)粒。對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行核酸序列測(cè)定，并對(duì)N基因碳末端456個(gè)核苷酸進(jìn)行序列系統(tǒng)樹(shù)分析。結(jié)果：RT—PCR后12份均檢測(cè)出590bp的特異性N基因目的條帶，經(jīng)RFLP后，顯示兩種類型的譜帶。通過(guò)對(duì)3株病毒重組質(zhì)粒的序列測(cè)定和分析證明，3株均為麻疹病毒H1基因型，其中1株為H1b亞型，另外兩株為H1a亞型。H1a的2株的456個(gè)核苷酸與H1b株的差異為3.07～4.17％。這3株的456個(gè)核苷酸與A基因型代表株序列的基因差異為6.36～7.23％，與H1基因型代表株的基因差異為1.53～2.41％。3株與A基因型代表株序列相比氨基酸有義突變共達(dá)16處。結(jié)論：2002年天津市麻疹散發(fā)病例的核酸序列為H基因型，本研究中所建立的實(shí)驗(yàn)方法可用于今后繼續(xù)監(jiān)測(cè)我市麻疹流行株的基因變異，對(duì)我國(guó)加速麻疹控制及麻疹消除、消滅是十分必要的。
【學(xué)位單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2003
【中圖分類】：R181.3
【部分圖文】：

用QiagenRNA抽提試劑盒提取的RNA，以RNA單鏈為模板，用引物Pl和PZ擴(kuò)增N基因片段，12份都產(chǎn)生了預(yù)期的590bp特異產(chǎn)物帶，陰性對(duì)照不被該引物所擴(kuò)增。說(shuō)明存在特異的RNA序列，電泳結(jié)果如圖1所示。

將麻疹病毒N基因片段用內(nèi)切酶Bcnl經(jīng)酶切后，12份中MV-9得到兩個(gè)290bp左右的片段，其余11份均被切為約290bp、80bp、230bp的三個(gè)片段。以加入去離子水為陰性對(duì)照，電泳結(jié)果如圖2所示。

(二)PCR產(chǎn)物的純化及含量估計(jì)經(jīng)Promega公司的PCR產(chǎn)物純化試劑盒提純的DNA溶于去離子水中，瓊脂糖凝膠電泳如圖3。鑒于條件所限，沒(méi)有通過(guò)檢測(cè)其吸光度估計(jì)含量。
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本文編號(hào)：2877319