發(fā)布時(shí)間：2020-06-08 00:14

【摘要】： 目的 慢性牙周炎是一種以牙周微生物為始動(dòng)因子,宿主免疫防御反應(yīng)參與的多因素的慢性破壞性炎癥性疾病。在牙周微生物中,牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis,P.gingivalis)是證據(jù)充分的牙周可疑致病菌,該菌具有多種毒力因子,如菌毛、牙齦素等,可促進(jìn)P.gingivalis粘附和侵入上皮細(xì)胞,導(dǎo)致上皮組織的直接破壞;同時(shí),上皮細(xì)胞在P.gingivalis及其產(chǎn)物的刺激下,細(xì)胞內(nèi)若干信號(hào)通路被激活,引起細(xì)胞的免疫炎癥反應(yīng),促進(jìn)了牙周炎癥的發(fā)生發(fā)展。P.gingivalis及其產(chǎn)物與上皮細(xì)胞之間的相互作用一直是牙周病學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。 本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用Western blot法檢測(cè)P.gingivalis ATCC 33277及其fimA缺陷突變株對(duì)牙齦上皮細(xì)胞的焦點(diǎn)粘附成分——焦點(diǎn)粘附蛋白Paxillin和焦點(diǎn)粘附激酶(focal adhesion kinase,FAK)蛋白表達(dá)的影響,探討菌毛的致病作用,進(jìn)一步研究P.gingivalis對(duì)牙周組織的破壞機(jī)制,從而豐富和完善牙周病病因?qū)W理論;采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)P.gingivalis膜泡誘導(dǎo)下牙齦上皮細(xì)胞前列腺素E_2(prostaglandin E_2,PGE_2)的蛋白分泌及環(huán)氧化酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2),白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-6和-8及基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)-1和-3的mRNA表達(dá)水平,從而考察牙齦上皮細(xì)胞對(duì)P.gingivalis膜泡刺激的免疫炎癥反應(yīng),建立細(xì)胞炎癥反應(yīng)模型,旨在揭示P.gingivalis的致病機(jī)理,并為闡述牙齦上皮細(xì)胞在局部免疫反應(yīng)中的作用提供證據(jù);同時(shí),檢測(cè)蛇麻子多酚(hop bract polyphenol,HBP),蘋(píng)果多酚(apple condensedpolyphenol,ACT)和綠茶多酚(epigallocatechin gallate,EGCg)對(duì)P.gingivalis膜泡誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥反應(yīng)的作用,試圖尋找一種新的牙周炎癥抑制劑,為牙周炎的預(yù)防和治療提供新的思路。 材料與方法 一、實(shí)驗(yàn)材料 1、菌株、細(xì)胞和主要試劑 P.gingivalis ATCC 33277野生株和fimA缺陷突變株(日本大阪大學(xué)齒學(xué)部中央實(shí)驗(yàn)室提供) 永生化人類(lèi)牙齦上皮細(xì)胞(日本大阪大學(xué)大學(xué)院齒學(xué)部牙周病學(xué)科Murakami教授惠贈(zèng)) 角化細(xì)胞特異性培養(yǎng)液(HuMedia KG2,Kurabo,Osaka,Japan) DMEM(Sigma Chemicals,St.Louis,MO) Paxillin和FAK單克隆抗體(Transduction Laboratories,Lexington,KY) ECL Plus Western blotting檢測(cè)試劑盒(Amersham Biosciences,UK) PGE_2免疫檢測(cè)試劑盒(RD Systems,Abingdon,UK) TRIzol(Invitrogen,Carlsbad,CA) 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen,Carlsbad,CA) SYBRGreen試劑(QIAGEN,Hilden,Germany) 2、主要儀器設(shè)備 超低溫冰箱(Sanyo,UltraLow,Japan) 厭氧培養(yǎng)箱(PLAS-LABS,USA) CO_2培養(yǎng)箱(Heraeus,Germany) 電泳儀以及Western blot全套專(zhuān)用設(shè)備(BIORAD,USA) 熱循環(huán)儀LightCycler 2(Roche Molecular Biochemicals,Mannheim,Germany) HBP(Fundamental Research Laboratory,Asahi Breweries Ltd,Japan) ACT(Fundamental Research Laboratory,Asahi Breweries Ltd,Japan) EGCg(Ftmakoshi Co.,Tokyo,Japan) 二、實(shí)驗(yàn)方法 1、細(xì)菌培養(yǎng):將P.gingivalis ATCC 33277野生株和fimA缺陷突變株培養(yǎng)于含有酵母浸出物和氯化血紅素的胰酶大豆肉湯培養(yǎng)基(trypsinase soy broth,TSB)中厭氧培養(yǎng)達(dá)到對(duì)數(shù)期。 2、膜泡的分離提取:經(jīng)離心和過(guò)濾去除P.gingivalis ATCC 33277培養(yǎng)液中的菌體,上清液進(jìn)行超速離心(100,000×g,1h,4℃),以500μl磷酸緩沖液溶解沉淀,即獲得牙齦卟啉單胞菌膜泡(vesicles)。用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒檢測(cè)膜泡溶液的蛋白含量,調(diào)整濃度為1mg/ml,-80℃凍存?zhèn)溆谩?3、細(xì)胞培養(yǎng):永生化人類(lèi)牙齦上皮細(xì)胞(immortalized human gingival epithelialcells,IHGE細(xì)胞)培養(yǎng)于角化細(xì)胞特異性培養(yǎng)液(HuMedia KG2)中,Hela細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)中,加入10%胎牛血清(fetal calfserum,FCS),在飽和濕度的環(huán)境中(95%O_2,5%CO_2,37℃)培養(yǎng)。 4、多酚的預(yù)備:HBP,ACT和EGCg以二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)溶解,使DMSO在實(shí)驗(yàn)中的終濃度為0.05%(v/v)。 5、Western blot檢測(cè)Paxillin和FAK的表達(dá):IHGE細(xì)胞和Hela細(xì)胞以DMEM(含10%FCS)培養(yǎng)于6孔板中至亞融合。向培養(yǎng)液中加入P.gingivalis ATCC33277野生株及其fimA基因缺陷突變株,使感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection,MOI)分別為0,50,200,500。分別在感染后0,30,60,120min時(shí)以Triton-裂解緩沖液處理細(xì)胞,收集細(xì)胞裂解液。蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis,SDS-PAGE)后,電轉(zhuǎn)印于聚偏氟乙烯(Polyvinylidene Fluoride,PVDF)膜上。先后與Paxillin或FAK一次抗體及辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記的二次抗體雜交后,顯影成像。 6、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)檢測(cè)P.gingivalis膜泡誘導(dǎo)的PGE_2分泌:IHGE細(xì)胞以HuMedia KG2細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)于96孔板中至亞融合。實(shí)驗(yàn)前將P.gingivalis膜泡以DMEM稀釋,使膜泡終濃度為25μg/ml和50μg/ml。將細(xì)胞培養(yǎng)于含有或不含有膜泡的DMEM中,6h和24h后,以ELISA試劑盒檢測(cè)上清液中PGE_2含量。 7、實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(real-time reverse transcription-polymerase chainreaction,real-time RT-PCR)定量檢測(cè)P.gingivalis膜泡誘導(dǎo)的前炎癥mRNA的表達(dá)水平:IHGE細(xì)胞以HuMedia KG2培養(yǎng)液培養(yǎng)于6孔板中至40%融合,繼而以DMEM孵育24h至亞融合。向培養(yǎng)液中加入P.gingivalis膜泡并使其終濃度達(dá)到50μg/ml,分別在0,1,3,6,9,12和24h以TRIzol處理單層細(xì)胞,提取總RNA。使用熱循環(huán)儀和SYBRGreen試劑將COX-2,IL-6,IL-8,MMP-1和MMP-3mRNA表達(dá)水平定量。 8、ELISA檢測(cè)HBP,ACT和EGCg對(duì)PGE_2的影響:以DMEM稀釋HBP,ACT和EGCg,使此三種多酚的終濃度為1,10,25μg/ml三個(gè)濃度梯度。將細(xì)胞培養(yǎng)于含有或不含有50μg/ml P.gingivalis膜泡及HBP,ACT和EGCg的DMEM中,24h后,以ELISA試劑盒檢測(cè)上清液中PGE_2含量。 9、Real-time RT-PCR法檢測(cè)HBP,ACT和EGCg對(duì)前炎癥mRNA表達(dá)水平的影響:向培養(yǎng)液中加入P.gingivalis膜泡使其終濃度達(dá)到50μg/ml,同時(shí)加入EGCg,HBP和ACT使其終濃度為1,10,25μg/ml。6h后,以TRIzol處理單層細(xì)胞,提取總RNA。使用熱循環(huán)儀和SYBRGreen試劑將COX-2,IL-6,IL-8,MMP-1和MMP-3 mRNA表達(dá)水平定量。 三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有的數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)來(lái)表示,使用非配對(duì)t-檢驗(yàn)進(jìn)行比較分析,P＜0.05時(shí)數(shù)據(jù)的差異具有顯著性。 結(jié)果 1、P.gingivalis對(duì)Paxillin和FAK的降解作用 P.gingivalis ATCC 33277野生株和fimA缺陷突變株能夠使IHGE細(xì)胞和HeLa細(xì)胞的Paxillin和FAK發(fā)生降解,其fimA缺陷突變株對(duì)Paxillin和FAK的降解能力較野生株顯著減弱。 2、P.gingivalis膜泡誘導(dǎo)的牙齦上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng) (1)以P.gingivalis膜泡(10,50μg/ml)刺激IHGE細(xì)胞,分別于6h和24h,ELISA檢測(cè)PGE_2的分泌水平。結(jié)果表明,于24h P.gingivalis膜泡(10,50μg/ml)顯著性濃度依賴(lài)性地促進(jìn)牙齦上皮細(xì)胞PGE_2的分泌。 (2)以P.gingivalis膜泡(50μg/ml)刺激IHGE細(xì)胞,分別在0,1,3,6,9,12和24h以Real-time RT-PCR法檢測(cè)IHGE細(xì)胞的COX-2,IL-6,IL-8,MMP-1和MMP-3mRNA的表達(dá)水平。P.gingivalis膜泡顯著性促進(jìn)牙齦上皮細(xì)胞COX-2,IL-6,IL-8,MMP-1和MMP-3 mRNA的表達(dá)水平。 3、HBP,ACT和EGCg對(duì)P.gingivalis膜泡誘導(dǎo)的牙齦上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)的作用 (1)HBP,ACT和EGCg對(duì)P.gingivalis膜泡誘導(dǎo)的PGE_2的影響:HBP在所有被測(cè)濃度(1,10,25μg/ml)均顯著性抑制了IHGE細(xì)胞的PGE_2分泌,呈濃度依賴(lài)性;EGCg僅在10,25μg/ml具有抑制PGE_2分泌的作用;而ACT對(duì)PGE_2的分泌無(wú)抑制作用。 (2)HBP,ACT和EGCg對(duì)P.gingivalis膜泡誘導(dǎo)的COX-2,IL-6,IL-8,MMP-1和MMP-3 mRNA表達(dá)水平的影響:HBP在10,25μg/ml顯著性抑制COX-2,IL-6,IL-8的mRNA表達(dá)水平,在25μg/ml顯著性抑制MMP-1和MMP-3 mRNA表達(dá);EGCg僅在10,25μg/ml能夠顯著性抑制COX-2的mRNA表達(dá),對(duì)IL-6,IL-8,MMP-1和MMP-3的mRNA表達(dá)無(wú)抑制作用;而ACT則對(duì)上述被測(cè)mRNA的表達(dá)均無(wú)抑制作用。 結(jié)論 1、P.gingivalis能夠使牙齦上皮細(xì)胞的焦點(diǎn)粘附成分Paxillin和FAK發(fā)生降解,菌毛介導(dǎo)的粘附和侵入可能對(duì)焦點(diǎn)粘附成分的降解起著促進(jìn)作用。IHGE細(xì)胞較Hela細(xì)胞對(duì)P.gingivalis的反應(yīng)更靈敏,更適用于牙周致病菌的研究。2、P.gingivalis及其產(chǎn)物與牙齦上皮細(xì)胞之間的相互作用是該菌感染牙周組織的起始和關(guān)鍵,除了該菌的直接破壞作用外,P.gingivalis膜泡可顯著性誘導(dǎo)牙齦上皮細(xì)胞的細(xì)胞炎癥反應(yīng),促進(jìn)前炎癥介質(zhì)的分泌和mRNA表達(dá),過(guò)度的免疫炎癥反應(yīng)可能是牙周炎發(fā)生發(fā)展的主要原因。 3、HBP對(duì)P.gingivalis引起的牙齦上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)具有顯著的抑制作用,具有成為牙周炎癥抑制劑的潛能,為牙周炎的預(yù)防和治療提供了新的思路。
【圖文】：

CW乙W乙W乙P袱illin圖1， westemblot法檢測(cè) pgingivalisATcC33277野生株和fimA缺陷突變株對(duì)IHGE細(xì)胞Paxillin蛋白表達(dá)水平的影響。A:MOI為200時(shí)，pgl’ngl’ valisATCC33277野生株及其filnA缺陷突變株均能夠使IHGE細(xì)胞的Paxillin顯著降解，在相同感染時(shí)間，filnA缺陷突變株對(duì)Paxillin的降解能力較野生株顯著減弱。B:感染后60min， pgingivofisATCc33277野生株和fimA缺陷突變株對(duì)Paxiliin的降解程度隨著MOI的增加而增大;Mol相同的情況下，fimA缺陷突變株對(duì)Paxillin的降解能力較野生株顯著減弱。c:對(duì)照組(無(wú)感染 );w:p91從蘿 valisATCc33277野生株;乙:pg動(dòng) lgivalisATCC 33277fimA缺陷突變株;MOI:感染復(fù)數(shù);Paxiliin分子量 :68kDa。

里紛..一-一一IKO人MF圖2， Westemblot法檢測(cè) pgingivalisATCC33277野生株和fin1A缺陷突變株對(duì)IHGE細(xì)胞FAK蛋白表達(dá)水平的影響。A:Mol為200時(shí)， pgingivalisATCC33277野生株及其fimA缺陷突變株均能夠使IHGE細(xì)胞的隊(duì)K發(fā)生降解，在相同感染時(shí)間，fimA缺陷突變株對(duì)Paxiliin的降解能力較野生株顯著減弱。B:感染后60min，， pgingivalisATCC33277野生株和6mA缺陷突變株對(duì)FAK的降解程度隨著MOI的增加而增大;MOI相同的情況下，五mA缺陷突變株對(duì)FAK的降解能力較野生株顯著減弱。C:對(duì)照組(無(wú)感染 );w:pgingivalisATCC33277野生株;乙:尸 gingivalisATCC 33277fimA缺陷突變株;Mol:感染復(fù)數(shù);FAK分子量 :125kDao
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類(lèi)號(hào)】：R781.4

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本文編號(hào)：2702213