【摘要】： 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?由慢性根尖周炎、牙周炎引起的牙槽骨缺損性疾病在臨床上頗為常見。成骨細(xì)胞(Osteoblast)位于骨組織表面，是骨形成以及損傷后修復(fù)重建過程中的重要功能細(xì)胞，成骨細(xì)胞在骨形成和改建過程中可以產(chǎn)生骨基質(zhì)并分泌多種生物活性物質(zhì)，如膠原纖維和無定形有機(jī)基質(zhì)，調(diào)節(jié)與影響著自身和破骨細(xì)胞的功能。而臨床上在由于感染引起的骨破壞性疾病中，大部分成骨細(xì)胞的消失并不是成骨細(xì)胞向骨細(xì)胞、骨基質(zhì)和骨膜方向轉(zhuǎn)化，而是發(fā)生了細(xì)胞凋亡。所以現(xiàn)行的牙槽骨缺損性疾病的治療方法難以獲得理想的療效。因而，探討成骨細(xì)胞增殖分化及凋亡的特性，從而研究一種促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖分化；阻止其凋亡的生物制劑，可以為臨床上骨缺損性疾病的生物學(xué)治療開辟新思路。近年來，隨著組織工程學(xué)在醫(yī)學(xué)各學(xué)科的研究不斷發(fā)展，骨替代產(chǎn)品應(yīng)用于骨缺損性疾病的治療已經(jīng)成為可能，因而研究一種理想的骨誘導(dǎo)劑應(yīng)用于臨床具有重要意義。 纖維粘連蛋白(Fibronectin，F(xiàn)N)是細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix，ECM)中糖蛋白的最重要成分，主要分布于疏松結(jié)締組織，除成纖維細(xì)胞外，上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和巨噬細(xì)胞也可生成。血漿型FN以單體形式存在，通過N-端的70×10~3Kda的蛋白質(zhì)與細(xì)胞表面特定區(qū)域發(fā)生聚合，單體之間通過二硫鍵橋彼此連接形成FN多聚體，F(xiàn)N的聚合是發(fā)揮其生物學(xué)功能的先決條件。FN單體是一種由相似的兩個(gè)肽鏈亞單位(A和B鏈)通過羧基端的二硫鍵結(jié)構(gòu)成為分子量約220×10~3Kda的多功能二聚體糖蛋白。由于FN對細(xì)胞的生長、增殖分化、粘附移動(dòng)、損傷修復(fù)等過程起到重要的作用，因而受到醫(yī)學(xué)各學(xué)科研究領(lǐng)域的重視。以往的實(shí)驗(yàn)證明：FN是成骨細(xì)胞增殖分化及凋亡的至關(guān)重要因子。 本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用外源性FN作用于體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞，旨在研究FN對成骨細(xì) 胞增殖分化及凋亡的影響，探討應(yīng)用FN治療骨缺損性疾病的可行性。 實(shí)驗(yàn)方法 1.成骨細(xì)胞的分離純化 取生后Zd的Wistar乳鼠拉頸處死后投人盛有75%乙醇的容器中消 毒，剪開頭頂部皮膚，取顱蓋骨放人盛有緩沖液的培養(yǎng)皿中，用緩沖液洗凈， 加人0.25%胰蛋白酶溶液，在37℃恒溫消化巧min。再用lm群血n型膠 原酶溶液在37℃條件下消化90 min，移于離心管中離心(1 O00r/min，5 min)用199培養(yǎng)液將沉淀物洗兩次，吹散細(xì)胞沉淀，制成細(xì)胞懸液，接種于 培養(yǎng)瓶內(nèi)。差速勃附法純化細(xì)胞。 2.成骨細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定 調(diào)整上述已純化的細(xì)胞懸液細(xì)胞密度至1護(hù)個(gè)/nil，接種于25nil培養(yǎng)瓶 內(nèi)，置于37T、5%COZ培養(yǎng)箱中，2d后換液，除去未貼壁細(xì)胞，并適時(shí)傳代， 另在一小培養(yǎng)皿中加人蓋玻片，接種少量細(xì)胞懸液，置于37℃、5%C02培養(yǎng) 箱中培養(yǎng)，用I型膠原免疫組化方法作細(xì)胞鑒定。 3.成骨細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察 應(yīng)用倒置相差顯微鏡動(dòng)態(tài)觀察成骨細(xì)胞的生長特性并拍照記錄。將培 養(yǎng)的成骨細(xì)胞用胰酶消化，離心，PBS沖洗，0 .3%的戊二醛和四氧化餓雙重 固定，乙醇逐級(jí)脫水，醋酸異戊醋置換，臨界點(diǎn)干燥，噴金鍍膜，S一520型掃 描電鏡觀察;培養(yǎng)形成單層細(xì)胞，經(jīng)膠原酶消化，分散離心獲得成骨細(xì)胞團(tuán) 塊，加人4%戊二醛預(yù)固定，餓酸染色，Hi魷achi一600型透射電鏡下觀察并 拍照紀(jì)錄。 4.Alam二cBlueTM法測定細(xì)胞增殖率 取培養(yǎng)的成骨細(xì)胞第3代，調(diào)整細(xì)胞濃度至2 x 104/血，以每孔100閃 接種于96孔板，每組8孔，培養(yǎng)條件為37℃，5%COZ飽和濕度。在含10% 胎牛血清的199液中培養(yǎng)48h，換成濃度為10林歲而，20林歲血，30林歲時(shí)， 40林群耐，50林?jǐn)U而的牛血漿FN，無血清培養(yǎng)72h，在最后4h每孔加入20閃 的AIamarBlu(，TM，37℃、5%CoZ培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育至結(jié)束，酶標(biāo)儀540run、 620nm波長下分別測定各孔吸光度，按說明書要求計(jì)算各組均數(shù)并作統(tǒng)計(jì) 分析。 5.EUSA方法檢測堿性磷酸酶(ALP)活性 細(xì)胞接種至24孔板，24h后換成濃度為ro林歲nil，20林歲nil，30林歲nil， 40林歲耐，50林?jǐn)U血的牛血漿FN，無血清培養(yǎng)72h。吸出培養(yǎng)液，加0.1% TritonX一100 100林l，置于4℃過夜，然后加人pNPP，37℃孵育30h，3N氫氧 化鈉終止反應(yīng)。將各孔液體分別移人%孔板，，用酶標(biāo)儀讀取OD值(波長 405nm)。 6.流式細(xì)胞術(shù)檢測FN對成骨細(xì)胞細(xì)胞周期及凋亡的影響 細(xì)胞以1 xlos/血接種至25d培養(yǎng)瓶，在含15%胎牛血清的199培養(yǎng) 液中培養(yǎng)3d。換為無血清199培養(yǎng)液。24h后加人濃度為10林歲耐，20林歲 血，30林歲血，40林歲nil，50林歲d的牛血漿FN，無血清培養(yǎng)72h，0.25%胰酶 消化各組細(xì)胞。pBS洗2次，加人配制好的pl染液(pl smg、RNase Zmg、生 理鹽水65耐、構(gòu)緣酸鈉loomg加蒸餾水100而，調(diào)PH值7.2一7.6)，37℃孵 育30min，用FACS流式細(xì)胞儀檢測，Ce斷t軟件收集10 000個(gè)細(xì)胞，Cell Quest軟件獲取并分析數(shù)據(jù)，根據(jù)G0/G:期、S期、GZ/M期細(xì)胞數(shù)。采用 sPss 1 0 .0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。 7.westem blotting法檢測FN作用后成骨細(xì)胞Bcl一2及Bax基因的蛋 白表達(dá)變化 處理后的細(xì)胞，PBS洗2次，離心，加人300閃的裂解buffer。超聲粉碎 后，12000甲而分，4℃，
【圖文】：

圖2分離培養(yǎng)24h后，成骨細(xì)胞貼壁生長(倒置相差顯微鏡x100)

成骨細(xì)胞在單層鋪滿培養(yǎng)瓶后可出現(xiàn)重疊生長，其中心部細(xì)胞密集并可發(fā)生鈣化，形成肉眼可見的散在鈣化結(jié)節(jié)(倒置相差顯微鏡x100)
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號(hào)】：R780.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2692907