本文關(guān)鍵詞：TLR4在破骨細胞中的生物學(xué)作用及其與經(jīng)典Wnt信號相互作用機制的初步研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：骨骼作為人體重要器官發(fā)揮著不可或缺的作用，與此同時骨疾病也成為人類面臨的重大疾病之一，近年來細菌感染導(dǎo)致的炎癥性骨疾病發(fā)生率逐漸增長，但是其治療仍然是難點�？谇恢谐Ｒ姷难装Y性骨疾病主要有慢性牙周炎和慢性根尖周炎，細菌是引起慢性根尖周炎和牙周炎的重要物質(zhì)，其中革蘭氏陰性菌占有主導(dǎo)地位，它可以產(chǎn)生脂多糖，脂多糖作為影響牙槽骨骨代謝的重要物質(zhì)，能造成牙槽骨的炎癥與吸收，最終導(dǎo)致牙齒喪失。正常的骨改建主要依賴成骨細胞和破骨細胞的相互交替作用而完成，炎癥時成骨細胞和破骨細胞在這一過程中的相互協(xié)調(diào)作用會被擾亂，從而發(fā)生骨的代謝異常。 目前研究報道TLR4可能參與了LPS引起的炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)相關(guān)炎癥因子的表達主要包括細胞因子和趨化因子，最終導(dǎo)致炎癥反應(yīng)發(fā)生。經(jīng)典Wnt信號通路不僅能調(diào)控成骨細胞、破骨細胞的增殖、分化和凋亡等，而且還在炎癥性骨疾病如慢性牙周炎和類風濕性關(guān)節(jié)炎中發(fā)揮著重要作用。最新研究報道，TLR4在新生小鼠回腸上皮中可以下調(diào)Wnt信號，然而關(guān)于TLR4與經(jīng)典Wnt信號在破骨細胞中相互作用機制的研究尚未見報道。既然TLR4與經(jīng)典Wnt信號通路在骨疾病都起到了如此重要的作用，我們便猜想這兩者在骨代謝過程中是否也會相互作用而影響骨組織的吸收和形成呢？ 本研究首先將LPS作為模擬成骨細胞和破骨細胞的炎癥微環(huán)境的介質(zhì)，然后利用LPS激活破骨細胞體內(nèi)的TLR4，進而采用細胞免疫熒光、實時熒光定量PCR、Western blot、細胞遷移等技術(shù)檢測TLR4在破骨細胞中的表達和作用，同時也研究了經(jīng)典Wnt信號通路在破骨細胞中的主要作用，以期進一步探討TLR4與經(jīng)典Wnt信號通路在破骨細胞中的相互作用機制。 研究內(nèi)容分為三部分： 1、 LPS體外模擬大鼠成骨細胞、破骨細胞的炎癥微環(huán)境 目的：將LPS作為模擬成骨細胞和破骨細胞炎癥微環(huán)境的主要介質(zhì)，檢測炎癥時成骨細胞和破骨細胞主要生物學(xué)特性的改變。 方法：分別配置含不同濃度（0、10ng/ml、100ng/ml、1ug/ml、10ug/ml）LPS的DMEM培養(yǎng)液，分別刺激成骨細胞、破骨細胞一定時間，利用MTT、堿性磷酸酶ALP染色、TRAP染色、ALP含量測定、RT-PCR等方法分別檢測LPS刺激細胞后其主要生物學(xué)特性的改變。 結(jié)果： （1）不同濃度LPS對成骨細胞的增殖和分化能力均有抑制作用，且都有濃度依賴性。10ug/ml LPS作用于成骨細胞24h后，其主要成骨相關(guān)標志酶ALP、Runx2mRNA表達水平均較對照組明顯降低（P0.05）。 （2）不同濃度LPS均可促進破骨細胞增殖和分化能力，且能增高破骨細胞破骨相關(guān)標志酶TRAP、MMP-9、CathinK mRNA的表達水平（P0.05）。 結(jié)論：LPS模擬成骨細胞和破骨細胞炎癥微環(huán)境時，可能造成成骨細胞的活性降低，而破骨細胞的活性增高。 2、 TLR4在炎性破骨細胞中的表達及其生物學(xué)效應(yīng) 目的：檢測TLR4在破骨細胞中的表達變化及炎癥時對破骨細胞遷移率和細胞內(nèi)破骨相關(guān)酶mRNA表達水平的作用。 方法：將實驗分為2組：（1）對照組：正常DMEM培養(yǎng)液（2）含10ug/ml LPS的DMEM培養(yǎng)液，兩組分別刺激細胞24h，利用PCR、Western、實時熒光定量PCR、細胞免疫熒光技術(shù)、細胞遷移等方法檢測TLR4在破骨細胞中的表達變化及炎癥時其對破骨細胞遷移率和破骨活性相關(guān)酶的作用。 結(jié)果： （1）TLR4在正常破骨細胞中是可以表達的，，且較對照組相比，LPS能激活其mRNA、蛋白水平及熒光強度在破骨細胞中的表達（P0.05）。 （2）TLR4被LPS激活后可作用于破骨細胞而增高細胞破骨相關(guān)酶的活性及細胞遷移率（P0.05）。 結(jié)論：破骨細胞內(nèi)TLR4被LPS激活后可能通過激活其下游某通路而導(dǎo)致破骨細胞活性增強。 3、經(jīng)典Wnt信號在炎性破骨細胞中的主要作用及其與TLR4的相互作用機制研究 目的：Wnt信號通路對炎性破骨細胞內(nèi)相關(guān)標志酶的主要作用及其與TLR4在破骨細胞中的相互作用進行研究。 方法：實驗隨機分為6組：空白對照組（正常培養(yǎng)液）、LPS組（10ug/ml）、Wnt3a組（100ng/ml）、DKK1組（200ng/ml）、LPS+DKK1組、LPS+Wnt3a組，分別與破骨細胞共同培養(yǎng)24h后；利用RT-PCR分別檢測破骨細胞中破骨相關(guān)酶酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9）、組織蛋白酶K(cathin K)、TLR4以及經(jīng)典Wnt信號通路中主要信號分子β-catenin、LRP-6mRNA表達水平。同時利用細胞免疫熒光技術(shù)檢測LPS激活TLR4后細胞內(nèi)β-catenin熒光強度的變化。 結(jié)果： （1）外源性Wnt3a、DKK1作用于破骨細胞后，Wnt3a能下調(diào)細胞內(nèi)破骨相關(guān)標志酶mRNA的表達水平、DKK1則上調(diào)其mRNA的表達水平（P0.05）；但兩者對TLR4mRNA的表達水平均無明顯作用（P0.05）。 （2）LPS可激活破骨細胞中TLR4的表達，其被激活后使破骨細胞內(nèi)各破骨相關(guān)酶mRNA的表達水平上調(diào)（P0.05）；同時LPS激活TLR4后可下調(diào)Wnt信號分子β-catenin、LRP-6mRNA的表達水平和β-catenin的熒光表達強度（P0.05）。 （3）將Wnt3a、DKK1、LPS+Wnt3a、LPS+DKK1分別作用破骨細胞24h后，與LPS單獨刺激相比，LPS聯(lián)合Wnt3a作用后使其對細胞內(nèi)相關(guān)酶表達的上調(diào)作用明顯降低（P0.05）；相反地，LPS聯(lián)合DKK1作用后也使其對細胞內(nèi)相關(guān)酶表達的上調(diào)作用進一步增強（P0.05）。 結(jié)論：TLR4可能通過抑制經(jīng)典Wnt信號而促進破骨細胞的活性；同樣，經(jīng)典Wnt信號也可能拮抗LPS參與的炎癥反應(yīng)過程中TLR4對破骨細胞相關(guān)酶的激活作用。
【關(guān)鍵詞】：破骨細胞 脂多糖 Toll樣受體4 β-catenin 經(jīng)典wnt信號 基質(zhì)金屬蛋白酶9 酒石酸酸性磷酸酶 組織蛋白酶K
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R781
【目錄】：

• 縮略語表5-6
• 中文摘要6-10
• 英文摘要10-14
• 前言14-16
• 文獻回顧16-24
• 一、成骨細胞、破骨細胞參與骨改建的研究進展16-18
• 1．成骨細胞在骨改建中的主要作用16
• 2．破骨細胞在骨改建中的主要作用16-17
• 3．成骨細胞與破骨細胞在骨改建中的相互作用17-18
• 二、脂多糖 LPS 參與骨疾病的研究進展18-19
• 三、TLR4 參與炎癥性骨疾病的研究進展19-21
• 1．TOLL 樣受體參與炎癥的研究進展19
• 2．TOLL 樣受體 4（TLR4）參與炎癥的研究進展19-21
• 四、經(jīng)典 WNT 信號通路參與炎癥性骨疾病的研究進展21-24
• 1．Wnt 信號通路在骨改建中的主要作用21-22
• 2. Wnt 信號通路參與炎癥性骨疾病的研究進展22-24
• 研究內(nèi)容24-54
• 實驗一 大鼠成骨細胞、破骨細胞的培養(yǎng)與鑒定24-32
• 1 材料24
• 2 方法24-26
• 3 結(jié)果26-31
• 4 討論31-32
• 實驗二 LPS 體外模擬大鼠成骨、破骨細胞的炎癥微環(huán)境32-39
• 1 材料32
• 2 方法32-34
• 3 結(jié)果34-38
• 4 討論38-39
• 實驗三 TLR4 在破骨細胞中的表達及其生物學(xué)效應(yīng)39-47
• 1 材料39
• 2 方法39-41
• 3 結(jié)果41-45
• 4 討論45-47
• 實驗四 TLR4 及經(jīng)典 WNT 通路在破骨細胞中的相互作用47-54
• 1 材料47
• 2 方法47-48
• 3 結(jié)果48-52
• 4 討論52-54
• 小結(jié)54-56
• 參考文獻56-66
• 個人簡歷和研究成果66-67
• 致謝67

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前5條

1 付斌;唐國華;;Wnt/β-連環(huán)蛋白信號途徑與骨改建[J];國際口腔醫(yī)學(xué)雜志;2010年05期

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  本文關(guān)鍵詞：TLR4在破骨細胞中的生物學(xué)作用及其與經(jīng)典Wnt信號相互作用機制的初步研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：255684