發(fā)布時間：2017-01-15 10:59

  本文關鍵詞：膜型基質(zhì)金屬蛋白酶1在預血管化膜片構建中的作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《蘭州大學》 2015年

預血管化的組織工程骨膜復合β-磷酸三鈣修復大鼠顱骨臨界缺損的實驗研究

高鵬  

【摘要】：目的：探索以大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(rat bone marrow mesenchymal stem cells,rBMSC)為基礎,利用細胞膜片技術在體外構建具有成骨和成血管特性的仿生無支架組織工程骨膜；并進一步將仿生骨膜與β-TCP復合,修復大鼠顱骨臨界缺損(critical-sized calvarial defects,CSD)。方法：(1)預血管化仿生骨膜的體外構建：全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)rBMSC,MTT法觀察細胞生長增殖周期；rBMSC在條件誘導液中(10μg/l血管內(nèi)皮細胞生長因子,VEGF;2μg/1堿性成纖維細胞生長因子,BFGF)向血管內(nèi)皮樣細胞(endothelial-like cells,ECs)誘導分化,于誘導后14天,鏡下觀察細胞形態(tài)變化,流式細胞儀檢測ECs表面標志物CD31；將rBMSC在干細胞培養(yǎng)介質(zhì)中連續(xù)培養(yǎng)14天形成未分化膜片,并將誘導獲得的ECs播種于未分化rBMSC膜片上,體外構建預血管化的細胞膜片,CD31免疫組化染色觀察膜片上血管網(wǎng)絡的形成；將rBMSC在成骨誘導介質(zhì)中連續(xù)培養(yǎng)14天形成膜片,14天后行堿性磷酸酶(ALP)染色,誘導21天后行茜素紅染色檢測細胞膜片成骨分化能力；將成骨膜片包裹β-TCP后,再與預血管化膜片復合形成仿生骨膜β-TCP復合物。體外復合培養(yǎng)3天,掃描電鏡(SEM)下觀察細胞與材料復合情況；(2)仿生骨膜／β-TCP復合體修復大鼠顱骨臨界缺損：將復合物植入大鼠顱骨8mm臨界缺損區(qū),以自體骨膜β-TCP,β-TCP,空白組作為對照組；于植入后2,4,8周處死動物,觀察缺損區(qū)修復情況。2周標本行HE染色,CD31免疫組化染色,并計數(shù)血管密度；4,8周標本行X線檢測；8周標本HE染色,Van Gieson染色,使用ImageJ軟件,計算各組標本新骨形成量。結果：(1)貼壁的原代rBMSC呈三角形,短梭形,克隆樣生長；傳代后細胞增殖快,呈典型的長梭形,MTT檢測生長曲線呈“S”型。加入內(nèi)皮細胞誘導液的rBMSC,14天時細胞變短,呈圓形,橢圓形,呈典型的鋪路石樣；流式細胞儀檢測ECs轉化率為35.1%；高密度體外培養(yǎng)的rBMSC 14天時,皿底可見細胞呈片狀,遮光性強,邊緣卷曲,鑷子可提起；ECs接種到單純rBMSC膜片后7天,鏡下可見細胞重新排列；CD31免疫組化染色后鏡下可見ECs遷移,聚集,形成空泡樣結構,管腔形成；成骨誘導形成的rBMSC膜片14天時ALP,21天時茜素紅染色呈陽性表達；仿生骨膜β-TCP支架材料體外復合培養(yǎng)3天掃描電鏡下(SEM)可見細胞向支架材料內(nèi)部生長遷移,鋪開。(2)植入物2周時,CD31免疫組化染色統(tǒng)計各組新生血管數(shù)顯示：仿生骨膜/β-TCP組血管化能力顯著高于β-TCP支架組,空白組(P0.05),與自體骨膜/β-TCP組相當(P0.05)。植入物8周時大體觀,仿生骨膜β-TCP組,自體骨膜β-TCP組材料部分吸收,β-TCP組未見明顯吸收,空白組缺損區(qū)纖維組織覆蓋；Van Gieson染色染色統(tǒng)計分析新生骨量,仿生骨膜/β-TCP組,自體骨膜β-TCP組新骨形成量無統(tǒng)計學差異(P0.05),兩組均大于β-TCP支架組和空白組(P0.05)。結論：(1)全骨髓貼壁法取材簡單易于掌握,細胞增殖力強；經(jīng)誘導形成的ECs播種在rBMSC膜片上共培養(yǎng)可以形成微血管網(wǎng)絡結構；rBMSC經(jīng)成骨誘導后可構建成骨分化能力的細胞膜片。(2)仿生骨膜／β-TCP可以用于大鼠顱骨臨界缺損的修復。

【關鍵詞】：
【學位授予單位】：蘭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R78
【目錄】：

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