本文關(guān)鍵詞：NGF調(diào)控CGRP表達(dá)促進(jìn)MG-63細(xì)胞增殖分化的實(shí)驗(yàn)研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《第三軍醫(yī)大學(xué)》 2015年

NGF調(diào)控CGRP表達(dá)促進(jìn)MG-63細(xì)胞增殖分化的實(shí)驗(yàn)研究

孫嵩  

【摘要】：口腔頜面部因?yàn)槟[瘤或者外傷造成的骨創(chuàng)傷和組織缺損一直是臨床的難點(diǎn)。隨著中國(guó)社會(huì)的飛速發(fā)展,口腔頜面部交通傷逐年增多,同時(shí)現(xiàn)代戰(zhàn)爭(zhēng)中對(duì)于頜面部的防護(hù)不足,造成戰(zhàn)創(chuàng)傷中頜面部傷的發(fā)生率達(dá)全身傷10%以上。因此,創(chuàng)傷修復(fù)機(jī)制的研究一直是基礎(chǔ)和臨床研究的熱點(diǎn)。骨創(chuàng)傷修復(fù)和愈合經(jīng)歷血腫形成,血腫機(jī)化,纖維骨痂的形成等一系列過(guò)程,包括免疫系統(tǒng)的參與,血管的生成和改建,成骨細(xì)胞的生成和募集。是一個(gè)由多細(xì)胞和多生長(zhǎng)因子參與調(diào)控的復(fù)雜過(guò)程,在此過(guò)程中既有成骨細(xì)胞和成骨相關(guān)細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子的調(diào)控作用,也有其他細(xì)胞通過(guò)旁分泌途徑產(chǎn)生的各種激素和調(diào)節(jié)因子的作用。大量的實(shí)驗(yàn)證明周圍神經(jīng)系統(tǒng)分泌的神經(jīng)肽類物質(zhì)在骨創(chuàng)傷修復(fù)中有著重要的生物學(xué)意義,降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene related peptide,CGRP),因在骨創(chuàng)傷愈合中發(fā)揮的至關(guān)重要的調(diào)控作用而受到廣泛關(guān)注。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中通過(guò)基因敲除小鼠和轉(zhuǎn)基因小鼠證明的CGRP具有明顯的成骨正效應(yīng);體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)CGRP有促進(jìn)成骨細(xì)胞(Osteoblast,OB)增殖作用,因而CGRP成為骨創(chuàng)傷愈合研究中的熱點(diǎn)和主體。但近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)也參與到骨創(chuàng)傷的修復(fù)和重建中,其中神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor,NGF)是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族(neurotrophic factor;neurotrophic factors,NTF)的重要成員,存在于骨形成細(xì)胞中,通過(guò)上調(diào)成骨細(xì)胞活性,引導(dǎo)神經(jīng)長(zhǎng)入骨痂來(lái)促進(jìn)骨的愈合。CGRP由神經(jīng)末梢釋放作用于靶細(xì)胞,而NGF由神經(jīng)靶細(xì)胞釋放,被神經(jīng)末梢攝取,兩者都具有明顯的促成骨效應(yīng),兩者是否有相互之間的信號(hào)聯(lián)系和調(diào)節(jié)機(jī)制報(bào)道少見(jiàn)。本實(shí)驗(yàn)基于以上想法,體外培養(yǎng)成骨肉瘤細(xì)胞株MG-63細(xì)胞,通過(guò)NGF干預(yù)MG-63細(xì)胞,檢測(cè)CGRP的表達(dá)狀況,探討NGF對(duì)骨修復(fù)過(guò)程中對(duì)CGRP的影響,以及對(duì)MG-63增殖和分化的作用,旨在加深對(duì)骨創(chuàng)傷愈合機(jī)制的認(rèn)識(shí),為臨床頜骨骨創(chuàng)傷愈合治療方法提供相關(guān)理論依據(jù)。方法:1.細(xì)胞培養(yǎng):人骨肉瘤細(xì)胞株MG-63細(xì)胞株購(gòu)買于ATCC公司,以8×106/瓶密度接種于100ml培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)傳代,加入含10%fcs的高糖dmem培養(yǎng)基,置于5%co2孵箱中37°c孵育48傳代,3-5代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。2.ngf對(duì)mg-63細(xì)胞增殖分化的調(diào)控作用。2.1mg-63細(xì)胞增殖:elisa法檢測(cè)ngf刺激mg-63細(xì)胞后cgrp表達(dá);q-pcr法測(cè)cgrpmrna表達(dá);cck-8法測(cè)mg-63細(xì)胞增殖。ngf濃度(0-100ng/ml),時(shí)效作用(1-4d)。2.2mg-63細(xì)胞分化:pnpp偶氮法檢測(cè)ngf對(duì)mg-63細(xì)胞alp染色的調(diào)控作用(100ng/ml);茜素紅染色檢測(cè)ngf對(duì)mg-63鈣化結(jié)節(jié)的量效作用(100ng/ml)。2.3.mg-63細(xì)胞中加入ngf受體阻斷劑(pd98059):q-pcr法測(cè)cgrpmrna表達(dá);cck-8法測(cè)mg-63細(xì)胞增殖。ngf濃度(0-100ng/ml),時(shí)效作用(1-4d)。3.mg-63細(xì)胞過(guò)表達(dá)ngf對(duì)cgrp的表達(dá)作用,以及對(duì)成骨標(biāo)志物的表達(dá)作用。3.1.mg-63細(xì)胞過(guò)表達(dá)ngf:rt-pcr,western-blot檢測(cè)cgrp以及mg-63細(xì)胞中alp、collageni的表達(dá)。時(shí)效作用(1-5d)。結(jié)果:1.ngf對(duì)mg-63細(xì)胞增殖分化的調(diào)控作用。1.1mg-63細(xì)胞增殖:elisa檢測(cè)發(fā)現(xiàn)mg-63細(xì)胞自身可以產(chǎn)生少量的cgrp,在ngf作用下,可以明顯上調(diào)mg-63細(xì)胞分泌的cgrp(p0.05),而且隨ngf濃度升高,cgrp有明顯的濃度依賴性。mg-63細(xì)胞上清液中cgrp的濃度隨不同濃度的ngf作用時(shí)間延長(zhǎng)也相應(yīng)增加(p0.05)。rt-qpcr檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在ngf作用下,可以明顯上調(diào)mg-63細(xì)胞分泌的cgrpmrna(p0.05),而且隨加入的ngf濃度升高,此作用也相應(yīng)增強(qiáng)。此外,mg-63細(xì)胞總rna中cgrpmrna的濃度隨不同濃度的ngf作用時(shí)間延長(zhǎng)也相應(yīng)增加(p0.05)。cck-8法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)加入ngf阻斷劑后的干擾組的mg-63細(xì)胞增殖效率明顯低于其余兩組(p0.05),而實(shí)驗(yàn)組加入ngf刺激后mg-63細(xì)胞增殖效率明顯高于空白對(duì)照組(p0.05),而且隨加入的ngf濃度升高,此作用也相應(yīng)增強(qiáng)。此外實(shí)驗(yàn)組ng-63細(xì)胞增殖效率隨不同濃度的ngf作用時(shí)間延長(zhǎng)也相應(yīng)增加(p0.05)。1.2mg-63細(xì)胞分化:pnpp偶氮法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)ngf刺激mg-63細(xì)胞的alp表達(dá)量明顯高于空白對(duì)照組(p0.05);茜素紅染色檢測(cè)發(fā)現(xiàn)ngf刺激mg-63細(xì)胞茜素紅染色計(jì)數(shù)高于對(duì)照組(p0.05)。1.3mg-63細(xì)胞中加入ngf受體阻斷劑:rt-qpcr檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在加入ngf阻斷劑后,可以明顯降低MG-63細(xì)胞分泌的CGRPm RNA(p0.05),而且隨加入的NGF濃度升高,此作用也相應(yīng)增強(qiáng)。此外在3d為NGF阻斷劑干擾時(shí)間的峰值(p0.05)。2.MG-63細(xì)胞過(guò)表達(dá)NGF對(duì)CGRP的表達(dá)作用,以及對(duì)成骨標(biāo)志物的表達(dá)作用。2.1 MG-63細(xì)胞過(guò)表達(dá)NGF:NGF過(guò)表達(dá)的慢病毒及空載體慢病毒轉(zhuǎn)染MG-63細(xì)胞后Real-time PCR結(jié)果顯示ALP、CollagenⅠ和CGRP的mRNA濃度比空載體組明顯升高(p0.05),且隨著NGF作用時(shí)間延長(zhǎng)也相應(yīng)增加(p0.05)。NGF過(guò)表達(dá)的慢病毒及空載體慢病毒轉(zhuǎn)染MG-63細(xì)胞后WB結(jié)果顯示ALP、CollagenⅠ和CGRP的表達(dá)量比空載體組顯著升高(p0.05),且隨著NGF作用時(shí)間延長(zhǎng)也相應(yīng)增加(p0.05)。結(jié)論:1.MG-63細(xì)胞自身可以產(chǎn)生少量的CGRP,在NGF作用下可以明顯上調(diào)MG-63細(xì)胞分泌的CGRP的表達(dá)量,而且隨NGF濃度升高,CGRP有明顯的濃度和時(shí)間依賴性。2.通過(guò)對(duì)NGF的信號(hào)阻斷可以有效抑制CGRP的表達(dá),且在3d為NGF阻斷劑干擾時(shí)間的峰值。3.NGF的表達(dá)能夠?qū)G-63細(xì)胞分泌的CGRP等多種成骨標(biāo)志物的表達(dá)量有促進(jìn)作用,有明顯的濃度依賴性和時(shí)間依賴性。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R782
【目錄】：

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7 任麗潔;多疣壁虎α型降鈣素基因相關(guān)肽（α-CGRP）基因的克隆及其表達(dá)分析[D];南通大學(xué);2009年

8 許兵;支配眼部三叉神經(jīng)神經(jīng)元CGRP表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究[D];華中科技大學(xué);2011年

9 劉星;CGRP對(duì)骺板生長(zhǎng)發(fā)育影響及其調(diào)控機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2009年

10 杜艷華;CGRP介導(dǎo)硝酸甘油延遲心臟保護(hù)涉及誘導(dǎo)型一氧化氮合酶[D];中南大學(xué);2003年

  本文關(guān)鍵詞：NGF調(diào)控CGRP表達(dá)促進(jìn)MG-63細(xì)胞增殖分化的實(shí)驗(yàn)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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