阿爾茨海默病(Alzheimer disease,AD)是老年癡呆的最常見類型,其神經(jīng)病理學(xué)特征主要表現(xiàn)為沉積在細(xì)胞外的老年斑(Senile plaques,SPs)和細(xì)胞內(nèi)聚集的神經(jīng)纖維纏結(jié)(Neurofibrillary tangles,NFTs)以及區(qū)域性的神經(jīng)元喪失。目前,對于AD的發(fā)病原因及其病理機制了解甚少,尚沒有有效的治療方法。β-淀粉樣多肽(β-Amyloid peptide,Aβ)是SPs的主要成分,來源于β-淀粉樣多肽前體蛋白(Amyloid precursor protein,APP)的蛋白剪切。大量研究表明Aβ的代謝異常可能是AD起始性的病理環(huán)節(jié)。研究Aβ的代謝對于探討AD的發(fā)病機理較為重要。 硫胺素(Thiamine)即維生素B_1,是人體必需的營養(yǎng)成分。硫胺素在體內(nèi)主要以焦磷酸硫胺素(Thiamine pyrophosphate,TPP)的形式存在,TPP是糖代謝途徑中的丙酮酸脫氫酶復(fù)合體,α-酮戊二酸脫氫酶復(fù)合體以及磷酸戊糖途徑中的轉(zhuǎn)酮醇的輔酶因子。硫胺素在維持腦內(nèi)氧化代謝平衡方面也發(fā)揮了重要作用。硫胺素缺乏(Thiamine deficiency,TD)會導(dǎo)致以上三種酶類的活性下降、三羧酸循環(huán)發(fā)生障礙、三磷酸腺苷(adenosine-triphosphate,ATP)產(chǎn)生受阻。此外,硫胺素缺乏過程中產(chǎn)生了大量的活性氧(reactive oxygen species,ROS),導(dǎo)致了氧化應(yīng)激的發(fā)生。主要依靠糖代謝提供能量的神經(jīng)組織對硫胺素缺乏高度敏感,硫胺素缺乏的中樞神經(jīng)表現(xiàn)稱為腦型維生素B_1缺乏癥,也稱韋尼克—科爾薩科夫綜合癥(Wernicke-Korsakoff's syndrome,WKS),病人除了有明顯的認(rèn)知喪失、記憶力減退外,晚期WKS病人出現(xiàn)腦室擴大,神經(jīng)元死亡。其腦內(nèi)的KGDHC活性也明顯降低。在硫胺素缺乏動物模型上,硫胺素缺乏處理的小鼠腦內(nèi)出現(xiàn)了神經(jīng)元死亡,小膠質(zhì)細(xì)胞、星型膠質(zhì)細(xì)胞肥大、增生等神經(jīng)退行性疾病的共同病理表現(xiàn)。此外,研究顯示,在AD病人中,TPP含量和TPP依賴型的酶類的活性都有明顯的下降,表明硫胺素缺乏可能在AD病理中起了一定的作用。但硫胺素缺乏在AD中的具體作用尚未得到系統(tǒng)的研究。 我們在體外培養(yǎng)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了瑞典型突變APP基因(APPsw)的人源神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株(SH-SY5Y)上和C57BL/6J小鼠上成功誘導(dǎo)了TD模型,并通過酶連免疫吸附實驗、免疫印跡實驗、免疫組織化學(xué)等技術(shù)手段系統(tǒng)地研究了TD對APP加工(APP processing)的影響以及其可能的機制。 首先,在APPsw SH-SY5Y細(xì)胞上,TD處理5天導(dǎo)致了大約13.5%的細(xì)胞死亡,發(fā)生凋亡的細(xì)胞增加了2倍。MTT法檢測表明TD處理5天導(dǎo)致細(xì)胞活力下降了大約50%。第二,酶連免疫吸附實驗測定Aβ的結(jié)果顯示:TD處理顯著增加細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)的Aβ的含量。與對照組(胞外的Aβ_(40)和Aβ_(42)分別是5.52±0.12和0.66±0.23 pg/ml·mg)相比,TD5天組胞外的Aβ_(40)和Aβ_(42)分別上升到18.57±2.31和3.85±0.52pg/ml·mg;細(xì)胞內(nèi)的Aβ_(40)和Aβ_(42)分別從對照組的23.4±5.1 7和7.06±1.03 pg/mg分別上升到86.03±8.19和23.52±1.02 pg/mg。第三,免疫印跡實驗顯示在TD過程中,細(xì)胞中成熟形式的APP蛋白水平降低,不成熟形式的APP蛋白水平?jīng)]有明顯變化。說明在TD過程中APP的表達(dá)水平?jīng)]有增加,應(yīng)該不是導(dǎo)致Aβ積累的原因。第四,酶活力測定的結(jié)果表明負(fù)責(zé)APP加工的β-分泌酶的活性在TD過程中明顯增高,而γ-分泌酶的活性在這一過程中沒有顯著性變化。前人研究結(jié)果證實β-site APP cleaving enzyme 1(BACEl)具有β-分泌酶的活性,我們分別從轉(zhuǎn)錄以及翻譯水平研究了BACE1基因的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)在TD處理過程中,BACE1基因的mRNA水平?jīng)]有明顯變化,BACE1的蛋白總量也沒有明顯改變。然而,與對照組相比,BACE1蛋白的成熟形式增加了大約2倍,而不成熟形式的BACE1降低了大約50%。表明β-分泌酶的活性調(diào)節(jié)不是通過增加BACE1基因的轉(zhuǎn)錄水平或翻譯水平,而是通過促進(jìn)BACE1蛋白的翻譯后修飾(BACE1蛋白的成熟過程)來實現(xiàn)的。為了進(jìn)一步確定β-分泌酶的活性在TD過程中明顯增高,我們檢測了TD過程中β-分泌酶產(chǎn)物:β-C terminalfragment(β-CTF)的變化,免疫印跡結(jié)果顯示β-CTF含量在TD過程中明顯增高。第五,TD處理5天后,補充硫胺素24小時明顯地減弱了BACE1蛋白的成熟過程,下調(diào)β-分泌酶的活性,降低了Aβ的積累。表明補充硫胺素對TD引起的Aβ的積累具有一定的補救作用。第六,在TD處理5天時,向培養(yǎng)液中添加β-分泌酶抑制劑24小時可以抑制Aβ和β-CTF的積累。第七,TD增加了細(xì)胞內(nèi)活性氧的積累,抗氧化劑Trolox不僅可以降低TD導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)活性氧的積累,也抑制了BACE1蛋白的成熟過程和Aβ的積累。表明氧化應(yīng)激可能是TD引起Aβ積累的內(nèi)在機制。最后,在TD處理過程中,添加低濃度(250pmol/L)的化學(xué)合成的Aβ到培養(yǎng)液里明顯加劇了TD導(dǎo)致的氧化應(yīng)激。表明Aβ的積累增強了TD引發(fā)的氧化應(yīng)激。 以上的離體實驗結(jié)果在TD小鼠模型上得到了驗證:(1)TD處理9天或更長時間會導(dǎo)致丘腦區(qū)域的丘腦中線旁丘腦核(Submedial thalamic nucleus,SmTN)出現(xiàn)明顯的神經(jīng)元死亡;(2)在TD小鼠丘腦區(qū)域,Aβ_(40)和Aβ_(42)含量顯著增加:對照組和TD10天組的Aβ_(40)分別是0.97±0.15和3.34±0.33 pmol/g;Aβ_(42)分別是0.16±0.01和0.49±0.02 pmol/g;(3)TD處理8天后補充硫胺素可以減少丘腦區(qū)域Aβ_(42)的積累。 綜上,我們的實驗結(jié)果表明:(1)由TD引起的氧化應(yīng)激導(dǎo)致了APP蛋白加工過程中產(chǎn)生了更多的Aβ;(2)氧化應(yīng)激的作用靶點是BACE1蛋白。進(jìn)一步,TD對β-分泌酶的活性調(diào)節(jié)是通過促進(jìn)BACE1蛋白的翻譯后修飾(BACE1蛋白的成熟過程)來實現(xiàn)的;(3)Aβ的積累也加劇了TD導(dǎo)致的氧化應(yīng)激。提示氧化應(yīng)激和Aβ的積累之間存在著正反饋的效應(yīng)。 本工作發(fā)現(xiàn)硫胺素缺乏引起的氧化應(yīng)激促進(jìn)了APP加工中產(chǎn)生更多的Aβ,Aβ的積累反過來加劇了硫胺素缺乏導(dǎo)致的氧化應(yīng)激。氧化應(yīng)激和Aβ的積累之間存在著正反饋的效應(yīng)。這一效應(yīng)很可能參與了AD的發(fā)生、發(fā)展。最后,體外、體內(nèi)補充硫胺素實驗都表明及時補充硫胺素可以緩解硫胺素缺乏對APP加工的影響,表明對于出現(xiàn)硫胺素缺乏相關(guān)癥狀的AD病人,考慮及時補充硫胺素是有益的。
【學(xué)位單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2008
【中圖分類】：R749.16
【部分圖文】：

圖2.p一淀粉樣多膚前體蛋白(Amyloidpreeursorprotein，App)加上(APPproeessing)過程示意圖。A即是一次跨膜的膜蛋白，N端的胞外部分可以被a一分泌酶或p一分泌酶切斷，產(chǎn)生了游離的多膚片段A即sa或者APPsp，剩余的c端片斷仍然留在膜上，因其所含的氨基酸個數(shù)而被稱為C83片段或者C99片段，也稱a一cTF或p一cTF。通過膜上的竹分泌酶的進(jìn)步剪切，C83片段被切成P3和APPintraeellula:domain(Aleo);e99片段則被切成p一amyloidpeptide(Ap)和AICD(該圖片改畫白FrankM.LaFerla，2005)。其正常的生理功能[l1一13]。在AD病人的腦組織中，構(gòu)象發(fā)生了改變的Ap聚集并沉積在胞外，與變性的神經(jīng)突起一起構(gòu)成了SPS，在SPs的周圍常常有激活的膠質(zhì)細(xì)胞【14，15]。Ap假說是目前最廣為接受的關(guān)于AD的假說，Ap假說認(rèn)為Ap的積累是導(dǎo)致AD的初始的和最重要的原因【16]。目一前己知常染色體上的三個基因的突變會導(dǎo)致家族型的阿爾茨海默病(familia:Alzheime:disease，F(xiàn)AD)，分別是21號染色體上的App基因[17]、14號染色體上的早老素l(presenilinl，Psl)基因[18、19]和l號染色體上的早老素2(presenilinZ，psZ)基因【20」。Psl或PsZ基因表達(dá)的蛋白與其它3種蛋白組成了Y一分泌酶復(fù)合體，負(fù)責(zé)產(chǎn)生Ap的

圖3.硫胺素(Thiaminedefieieney，TD)缺乏對砂pswsH一sv5y細(xì)胞增殖、死亡的影響。A.四種培養(yǎng)條件下細(xì)胞的增殖、死亡情況。10倍物鏡下拍攝明場照片。B，MTT法檢測細(xì)胞活力的結(jié)果，以對照組(Ctrl)為100%。C.AnnexinV+PI雙染色的流式細(xì)胞儀分析結(jié)果。較大字體的數(shù)值代表AnnexinV陽性細(xì)胞的百分比，小字體的數(shù)值為Pl陽性細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。ctrl:完全培養(yǎng)液對照組;Ctri+Py:完全培養(yǎng)液加pyrithiamine組;TDM:硫胺素缺乏培養(yǎng)液組;TDM+即硫胺素缺乏培養(yǎng)液加pyrithiamine組。0day指接種細(xì)胞24小時后，更換培養(yǎng)液后這一時間點。(*P<0.05and**P<0.01)綜合上面三個實驗的結(jié)果，我們得出以下結(jié)論:嚴(yán)重的TD會導(dǎo)致APPswSH一SYSY細(xì)胞死亡，在本實驗中，我們未觀察到TD對細(xì)胞增殖產(chǎn)生明顯影響。此外，單純添加30onmol幾的硫胺素拮抗劑pyrithiamine對細(xì)胞沒有產(chǎn)生明顯致死作用。因此，在接下來的體外細(xì)胞實驗中，我們選擇了添加pyrithiaminc的TD處理，并將添加300nmol/Lpyrithiamine的處理最長時間點設(shè)定在5天;對照組只采用普通的DMEM培養(yǎng)液處理。在這樣的條件下，細(xì)胞僅有輕微的死亡發(fā)生，可以最大限度避免因細(xì)胞死亡過程中固有的變化被誤認(rèn)為是由TD處理導(dǎo)致的特

TD導(dǎo)致Ap的積累
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本文編號：2885288