【摘要】：研究背景及目的:內(nèi)皮細胞(endothelial cells,EC)NF-кB信號在敗血癥、動脈粥樣硬化等炎癥相關疾病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。內(nèi)皮細胞坐落于由多種生物大分子組成的基底膜(basement membrane,BM)之上。盡管過往有大量文獻報道了基底膜各單一組分或基底膜替代物(如Matrigel)對EC生物學功能的調(diào)控作用,但這些體外基底膜研究模型在化學成分和/或物理性狀方面均與真正基底膜存在顯著差異,而來源于體內(nèi)、保存了基底膜真實性和完整性的羊膜或腸系膜基底膜體外研究模型被長期忽視,目前仍缺乏關于基底膜作為整體是否以及如何調(diào)節(jié)EC功能的研究。基于非炎性狀態(tài)下內(nèi)皮細胞具有完整的基底膜而炎癥狀態(tài)下的毛細血管內(nèi)皮細胞失去基底膜完整性這一體內(nèi)觀察結果,我們利用來源于腸系膜的基底膜體外研究模型,探討了基底膜作為一個整體調(diào)控內(nèi)皮細胞炎癥信號的可能性。在觀察到完整基底膜在體外抑制內(nèi)皮細胞NFκB炎癥信號的同時增強內(nèi)皮細胞間粘附的結果后,我們對其分子機制展開了深入研究,并利用Lox P-Cre技術試圖建立血管選擇性的體內(nèi)基底膜基因敲除小鼠模型,為后繼體內(nèi)研究基底膜完整性對內(nèi)皮細胞NFκB炎癥信號的調(diào)控作用提供動物模型。研究方法:(1)從活體大鼠體內(nèi)獲取大網(wǎng)膜,制備保持基底膜完整性和真實性的基底膜模型。(2)利用蛋白免疫印跡(Western Blot)、RT-PCR、NFкB熒光素酶報道基因等技術,研究NFκB信號活化程度差異及相關蛋白表達。(3)利用高鹽洗脫、激活白細胞孵育等方法破壞基底膜完整性,研究基底膜完整性對內(nèi)皮細胞NFκB信號的影響。(4)利用重組慢病毒介導的sh RNA靜默VE-Cadherin表達以及不同細胞培養(yǎng)密度研究VE-Cadherin介導的細胞間粘附對內(nèi)皮細胞NFκB信號的影響。(5)利用熒光素酶報道基因與Western Blot等技術研究基底膜通過調(diào)控VECadherin表達進而調(diào)控β-Catenin轉錄活性及β-Trcp1表達水平,從而調(diào)控IκB表達水平及NFκB信號。(6)利用GST融合蛋白下拉(pulldown)技術研究VE-Cadherin對Rho A小GTPase活性的影響,進而利用基因點突變技術研究Rho A活性對NFкB活性的影響。(7)利用VE-Cadherin-Cre/Lox P技術建立血管基底膜組織特異性Laminin-γ1基因敲除小鼠品系,為研究血管基底膜完整性對NFκB信號的影響提供動物模型。研究結果:(1)從體內(nèi)分離出來的大網(wǎng)膜基底膜組織能夠抑制內(nèi)皮細胞NFκB信號通路;(2)基底膜的完整性對抑制內(nèi)皮細胞NFκB信號至關重要;(3)完整基底膜通過增強內(nèi)皮細胞VE-Cadherin介導的細胞間粘附抑制NFκB信號;(4)VE-Cadherin能夠抑制β-Catenin轉錄活性而降低β-TRCP1表達,β-TRCP1調(diào)控底物IκB蛋白質穩(wěn)定性升高,最終抑制NFκB信號;(5)VE-Cadherin能夠降低Rho A活性,進而抑制下游NFκB信號。研究結論:完整基底膜在體外抑制內(nèi)皮細胞NFκB信號,此抑制作用通過VECadherin介導的細胞間粘附進而調(diào)控β-catenin轉錄活性以及Rho A活性而實現(xiàn)。
【圖文】：

其下游的NF κB表達；另一方面VE-Cadherin抑制與其胞內(nèi)段結合的分子β-Catenin進入胞核，減弱β-Catenin對CRD-BP的穩(wěn)定作用，導致β-TRCP1表達減少，使得I κBα穩(wěn)定提高，最終抑制了NF κB信號。如圖1所示。圖1基底膜調(diào)控內(nèi)皮細胞NF κB信號機制的猜想Figure 1 Conjecture of the basement membrane regulating the signaling mechanism of NF κB inendothelial cells

圖 3 基底膜 Transwell 培養(yǎng)示意圖Figure 3 Schematic diagram of basement membrane Transwell culture3.2.2 HUVEC 細胞的獲得與培養(yǎng)HUVEC 細胞通過膠原酶消化的方式，由江蘇大學附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科提供的鮮臍帶中分離而獲得。培養(yǎng)基成分為培養(yǎng)基 199（Gibco），并含 20％人血清50μg/ mL 內(nèi)皮細胞生長補充物（BDBiosciences），100U/mL 青霉素和 100μg鏈霉素成分。并用生長因子混合物刺激，包括 100 ng / mL 人血管內(nèi)皮生長因（VEGF），50 ng / mL 人肝細胞生長因子（HGF），10ng / mL 人 TGFβ，0.5mLTGFβ1 和 100μg/ mL 肝素。3.2.3 小鼠的繁殖與鑒定（1）小鼠的獲得LamC1 fl/+ 小鼠購于美國 The Jackson Laboratory，委托南京大學模式動研究所代為進口，該小鼠已被成功用于基底膜對神經(jīng)系統(tǒng)功能影響的研究,品
【學位授予單位】：江蘇大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R363

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6 田，

本文編號：2642411