【摘要】：人偏肺病毒(Human metapneumovirus,HMPV)可造成兒童、免疫力低下成年人和老年人呼吸道感染。研究表明,人偏肺病毒的流行歷史至少為65年,幾乎每個(gè)幼兒在5歲之前都曾經(jīng)感染過HMPV。當(dāng)病人感染該病毒時(shí),其主要的癥狀包括發(fā)燒、咳嗽、流鼻涕,嚴(yán)重者會(huì)引起更嚴(yán)重的肺炎和支氣管炎。人偏肺病毒是肺病毒科,偏肺病毒屬,是單股負(fù)鏈RNA病毒。人偏肺病毒的F基因和N基因在4個(gè)亞型中是相對(duì)保守的基因,因此,它們常被用作病毒檢測(cè)的靶基因。目前對(duì)于該病毒的檢測(cè)方法主要有傳統(tǒng)RT-PCR法、免疫熒光檢測(cè)法和熒光定量PCR檢測(cè)法。在本次實(shí)驗(yàn)中,通過比對(duì)4種不同亞型的病毒的全長F基因序列,在其保守的部分,設(shè)計(jì)了一對(duì)PCR引物,理論擴(kuò)增序列長度為526bp。運(yùn)用傳統(tǒng)的RT-PCR方法對(duì)所獲得的臨床咽拭子樣本或細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)我們合成了526bp長的序列并插入到克隆載體中作為陽性對(duì)照模板。通過瓊脂糖凝膠電泳分析,可確定標(biāo)本是偏肺病毒核酸陰性或陽性,該方法擴(kuò)增效率相對(duì)較高、簡單快速,通過進(jìn)一步測(cè)序驗(yàn)證和比對(duì)可確定樣本是否含有偏肺病毒。由于病毒分離是病毒檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn),然而目前國內(nèi)外并沒有成熟統(tǒng)一的病毒培養(yǎng)方法,因此我們參照國內(nèi)外相關(guān)研究,利用青島地區(qū)和廣州地區(qū)的咽拭子樣本或細(xì)胞培養(yǎng)物樣本進(jìn)行病毒培養(yǎng)方法的優(yōu)化和摸索。我們分別在TPCK濃度和細(xì)胞株選擇上進(jìn)行了優(yōu)化分析,最終選擇了LLCMK2細(xì)胞以及1 μg/ml的胰酶處理病毒感作中的細(xì)胞,并按照以上方法成功將廣東地區(qū)HMPV核酸陽性的樣本在細(xì)胞上進(jìn)行了P1至P4的傳代,然而青島地區(qū)HMPV核酸陽性的樣本并未成功適應(yīng)細(xì)胞。我們推測(cè)原因主要是,其一待培養(yǎng)樣本中病毒載量低且病毒不穩(wěn)定易丟失,其二細(xì)胞培養(yǎng)方法和體系仍需進(jìn)一步優(yōu)化。研究表明偏肺病毒的G基因在4個(gè)亞型之間變異較大,被用作分型的依據(jù)。因此本研究中通過在G基因兩端保守區(qū)設(shè)計(jì)PCR引物并擴(kuò)增全長(理論長度為942bp)。通過RT-PCR,我們從4個(gè)待檢樣本(包括臨床咽拭子和細(xì)胞培養(yǎng)物)分別擴(kuò)增出4條全長G基因,并測(cè)序,通過與Genbank中國大陸地區(qū)的80條G基因參考序列比對(duì),建立了進(jìn)化樹,結(jié)果發(fā)現(xiàn)來自青島的3個(gè)樣本中其中2個(gè)為A2亞型,1個(gè)為B1亞型,另外來自廣州的1個(gè)樣本為A2亞型,而進(jìn)化樹中的參考序列中65%為A2亞型,表明A2亞型仍是中國大陸地區(qū)分布最廣的人偏肺病毒的。本研究中,通過設(shè)計(jì)10對(duì)簡并引物,利用RT-PCR擴(kuò)增方法,對(duì)樣本進(jìn)行偏肺病毒全基因組序列擴(kuò)增和測(cè)序,將測(cè)序結(jié)果拼接并得到約13kb的序列,目前遺留基因組中3'端的約100 bp和5端的約200 bp仍未測(cè)通。為了研究該病毒的不同基因間序列對(duì)于病毒轉(zhuǎn)錄的調(diào)控作用,我們構(gòu)建了4個(gè)雙順反子微基因組質(zhì)粒,該質(zhì)粒包含上游和下游兩個(gè)報(bào)告基因,基因區(qū)之間含有不同的間區(qū)。以上間區(qū)分別是病毒基因組中的NP基因間區(qū)(包含N基因的gene end區(qū)和P基因的gene start區(qū)以及特有的調(diào)控序列)、FM2基因間區(qū)、M2SH基因間區(qū)和GL基因間區(qū),這些間區(qū)序列代表了人偏肺病毒全基因組中的前、中、后的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)止位點(diǎn),并進(jìn)一步分析它們?cè)谵D(zhuǎn)錄調(diào)控中的機(jī)制。通過與輔助質(zhì)粒(即病毒N、P、L和M2-1表達(dá)質(zhì)粒)轉(zhuǎn)染BSRT7/5過程細(xì)胞,檢測(cè)報(bào)告基因的瞬時(shí)表達(dá)水平,并,分析不同基因間序列對(duì)于病毒的轉(zhuǎn)錄效率的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),不同偏肺病毒的的GE序列可能對(duì)轉(zhuǎn)錄終止活性有影響,不同的GS序列與聚合酶結(jié)合并啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄效率不同。然而病毒基因組具體的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制仍需進(jìn)一步研究,本研究構(gòu)建的微基因組系統(tǒng)可提供便利的研究工具。
【圖文】：

２偏肺病毒的毒粒結(jié)構(gòu)逡逑Ｆｉｇ．邋１－２邋Ｔｈｅ邋ｖｉｒｉｏｎ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ＨＭＰＶ逡逑如圖１－２所示，電鏡觀察到的病毒粒子形態(tài)與肺病毒科的其他病毒相似。偏逡逑肺病毒是多形性病毒，直徑在１５０到６００ｎｍ之間。它們具有脂質(zhì)包膜，包膜內(nèi)逡逑含有三種表面糖蛋白（Ｆ、ＳＨ和Ｇ），形成１３？１７邋ｎｍ的刺突。病毒的負(fù)意鏈（１３逡逑ｋｂ）ＲＮＡ與病毒的核蛋白Ｎ、磷蛋白Ｐ、聚合酶Ｌ關(guān)系非常密切，也可能與轉(zhuǎn)錄逡逑調(diào)節(jié)因子Ｍ２－１蛋白和Ｍ２－２蛋白相關(guān)，形成的核衣殼Ｃ直徑１７邋ｎｍ，長度２００？６５０逡逑ｎｍ）是螺旋對(duì)稱結(jié)構(gòu)［１７１。逡逑６逡逑

Ｒｆｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ邋（ＲＮＰ）逡逑ｃｏｍｐｌｅｘ邋（ｅｎｌａｒｇｅｄ邋ｖｉｅｗ）逡逑圖１，２偏肺病毒的毒粒結(jié)構(gòu)逡逑Ｆｉｇ．邋１－２邋Ｔｈｅ邋ｖｉｒｉｏｎ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ＨＭＰＶ逡逑如圖１－２所示，電鏡觀察到的病毒粒子形態(tài)與肺病毒科的其他病毒相似。偏逡逑肺病毒是多形性病毒，直徑在１５０到６００ｎｍ之間。它們具有脂質(zhì)包膜，包膜內(nèi)逡逑含有三種表面糖蛋白（Ｆ、ＳＨ和Ｇ），形成１３？１７邋ｎｍ的刺突。病毒的負(fù)意鏈（１３逡逑ｋｂ）ＲＮＡ與病毒的核蛋白Ｎ、磷蛋白Ｐ、聚合酶Ｌ關(guān)系非常密切，，也可能與轉(zhuǎn)錄逡逑調(diào)節(jié)因子Ｍ２－１蛋白和Ｍ２－２蛋白相關(guān)，形成的核衣殼Ｃ直徑１７邋ｎｍ，長度２００？６５０逡逑ｎｍ）是螺旋對(duì)稱結(jié)構(gòu)［１７１。逡逑６逡逑
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R373

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