背景和目的乙型肝炎是一種由乙型肝炎病毒感染所引起的傳染性疾病,我國是乙型肝炎的高發(fā)地區(qū)。乙型肝炎病毒能夠穿過血睪屏障,并能進入精子細胞核中整合在染色質上,因此病毒可以通過生殖細胞進行垂直傳播。HBV感染伴隨著大量表觀遺傳學的修飾改變,但其影響精子質量的發(fā)病機制目前尚未完全闡明。隨著輔助生殖技術的進步,卵子受精時對精子質量的要求大大降低,但父源HBV病毒是否通過精子能影響胚胎的發(fā)育以及其影響機制,有待進一步闡明。研究HBV對人精子功能影響是乙肝病毒感染分子生物學和生殖醫(yī)學的交叉領域,研究精子組蛋白表觀遺傳修飾對精子及對胚胎發(fā)育的影響,有助進一步明確HBV導致男性生育力改變的原因。也為研發(fā)提高男性生育力的治療及阻斷乙肝病毒垂直傳播提供理論依據(jù)。研究方法回顧性分析2014年1月至2016年1月至我院生殖中心行輔助生殖技術治療(IVF/ICSI)的配偶2359對。按是否感染HBV進行分組分析男方的精液質量及子代胚胎的發(fā)育情況;收集HBV患者精液樣本,利用表達譜芯片初步探討HBV感染者對男性精子的影響,篩選差異表達基因進行分析;篩選出差異表達基因H3K9me3,用免疫共沉淀技術篩選與H3K9me3及HBx在精子中相關的蛋白,采用RTqRCP、western-blot驗證芯片分析結果;采用慢病毒轉染技術構建Hbx穩(wěn)定表達鼠精原細胞,用細胞周期實驗、凋亡實驗、小RNA干擾表達等多個實驗對HBx蛋白影響精細胞的機制進行探討;動物實驗探討HBx蛋白對胚胎的發(fā)育的影響。采集小鼠卵及精子進行轉染及其甲基化水平進行分析,觀測其表達及對胚胎發(fā)育的影響。結果乙肝表面抗原陽性的男性患者精子濃度、精子總數(shù)、PR率、精子存活率較低,畸型精子率更高;父系乙肝病毒感染影響ICSI結局、正常受精率、優(yōu)胚率低于抗原陰性組;乙肝病毒高拷貝數(shù)使精子質量和優(yōu)胚率下降;在HBV患者精子中存在多種差異表達基因,包括H3K9me3、組蛋白甲基轉移酶(Suv39H1)、DNA甲基轉移酶、HBx蛋白。其功能涉及組蛋白修飾、精子發(fā)生、細胞分化、染色質形成;進一步研究發(fā)現(xiàn)Hbx在精子中能引起Suv39H1的下調,從而引起組蛋白H3K9me3的下降、導致精子組蛋白替換異常、精子DNA損傷、精原細胞細胞周期停滯、凋亡增加。HBx的表達可能受UBP1的調控,HBx能與E2F5共同作用抑制Suv39H1的表達。動物實驗顯示轉染HBx后精子高表達H19、KCNQ1OT1,低表達IGF2。在體外培養(yǎng)系統(tǒng)中,小鼠精子轉染HBx后未見對植入前胚胎的發(fā)育產生影響。結論HBV感染患者能在精原細胞表達HBx蛋白,通過HBx蛋白使精子組蛋白替換異常、精子DNA損傷、細胞分裂減慢、凋亡增加,精子的數(shù)量和質量下降。在動物實驗中HBx能影響部分印跡基因控制區(qū)域甲基化水平。
【學位單位】：廣州醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R714.8;R512.62
【部分圖文】：

圖 2-1 樣品相關性聚類分析熱圖2.2 散點圖特征分析本研究中表達差異基因數(shù)據(jù)，將其數(shù)值轉化為 log 以 2 為底的對數(shù)后，在一個二維直角坐標系平面中，繪制成圖 2-2 所示的散點圖。圖中可見，每一個點代表芯片上的某一個基因探針的表達量。該點在散點圖中的分布位置由其 X 軸坐標和 Y軸坐標確定：X 軸代表該基因在乙肝陽性組中換算后的表達量。Y 軸代表該基因在非乙肝對照組中換算以后的表達量。紅色點表示 1.5 倍上調基因共 1239 個，綠色點表示 1.5 倍下調基因共 1161 個，無差異基因 29581 個。散點圖的相關系數(shù)為 0.9723，相關性較好。

圖 2-2 差異基因散點圖征分析于反映具備差異表達的基因的數(shù)目及其分布情況。圖 2)值，即由 t-檢驗計算所得的 P-value 值的以 10 為底的對數(shù)2 (Fold Change)，即兩組樣本間的差異倍數(shù)的以 2 為底的表達的上調或下調。紅色區(qū)域代表 P-value <0.05，F(xiàn)old基因，即表達量顯著差異共 214 個，綠色區(qū)域代表 P-val0 的有差異的下調基因，即表達量顯著差異共 86 個，無681 個。

圖 2-3 差異基因的火山圖因染色體分布一步了解差異基因的功能，采用 genome browser 和 RNAplex，找染色體的位置，統(tǒng)計所有差異基因在染色體的分布位點，繪制標為基因數(shù)目，橫坐標為染色體位置，深色的柱子為上調基因的基因。圖中可見，顯著上調的基因主要分布在 1 號、3 號、5體上，顯著下調的基因主要分布在 2 號、11 號、22 號染色體上最多顯著差異基因。

【參考文獻】

相關期刊論文 前4條

1 何偉鋒;甘愛華;張曉慧;鄒錦秀;林占洲;;干擾素阻斷乙型肝炎病毒父嬰傳播臨床研究[J];中國醫(yī)藥導報;2013年10期

2 張榮蓮;羅穎;謝婧嫻;陳起燕;成玲;郭勝斌;黃欣欣;;HBV父嬰垂直傳播水平與HBV-DNA載量的相關研究[J];中華流行病學雜志;2010年02期

3 卞廷松;徐福松;楊光;史兵偉;周華;;男性不育癥患者精子核蛋白組型轉換異常的檢測與分析[J];臨床檢驗雜志;2008年02期

4 陳暉,陳松,費江楓,趙躍華,金偉,曹堅,費仁仁;1050例不育男性精子堿性核蛋白的分析[J];生殖醫(yī)學雜志;2005年03期

本文編號：2827444