【摘要】：安乃近(Dipyrone)又名羅瓦爾精,是一種吡唑酮類的解熱鎮(zhèn)痛抗炎藥,使用至今已有近百年的歷史。近年來,各類藥品的毒副作用漸漸引起人們的注意,自上世紀七十年代以來各國對安乃近的臨床深入研究發(fā)現(xiàn),在使用人群中有大量患者的毒副作用較為嚴重,甚至危及生命。因此,許多發(fā)達國家開始漸漸減少安乃近的使用直至禁用,盡管如此,部分地區(qū)安乃近的使用量依然很大。我國早在1982年就將復方安乃近片列為禁止使用的藥品,但安乃近片劑及注射劑等至今仍在使用。針對日趨嚴重的動物性食品獸藥殘留問題,如何篩選含有殘留物的動物性食品,避免其進入市場至關重要,其中檢測分析手段是必不可少的一環(huán)。目前針對安乃近及其代謝產(chǎn)物殘留的分析方法主要是一些理化分析法,這些檢測方法雖準確性高、特異性強但需要使用的儀器價格昂貴、樣品前處理過程復雜、操作復雜、耗時長、且對操作人員的專業(yè)水平有一定要求,無法在基層機構普及。而免疫學檢測法是基于抗原抗體特異性反應原理的一種快速檢測分析方法,相比于理化分析法,該方法使用方便,檢測過程快速高效,檢測結果準確,適用于大量樣本的檢測。本試驗旨在建立一種快速檢測安乃近殘留的免疫學分析方法,為安乃近在動物源性食品殘留監(jiān)控及檢測上提供科學依據(jù)。1.安乃近人工抗原的制備及鑒定安乃近進入機體后迅速分解,血漿中無法檢測出安乃近原型藥成分,故本試驗針對安近的代謝產(chǎn)物4-氨基安替比林進行研究。4-氨基安替比林是小分子化合物,本試驗采取戊二醛兩步合成法將4-氨基安替比林分別與載體牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶聯(lián)制備出了兩種人工抗原,分別作為免疫原(AA-BSA)和包被原(AA-OVA)。經(jīng)紫外分光光度法與免疫學方法進行判定,結果證明人工抗原偶聯(lián)成功。2.安乃近單克隆抗體的制備及鑒定使用人工抗原AA-BSA作為免疫原接種小鼠,在第五次免疫后采集、制備小鼠血清并進行間接ELISA檢測,結果血清中效價可達1:256000。通過單克隆抗體技術,在免疫程序結束后取血清效價高的小鼠脾臟細胞與處于對數(shù)生長期的小鼠骨髓瘤細胞進融合,經(jīng)過三次亞克隆,篩選出兩株雜交瘤細胞株分別命名為3B6、7G6。通過進一步篩選后將7G6單克隆細胞株注入小鼠腹腔,利用體內(nèi)誘生法共制得腹水16mL,通過BCA法測定化前腹水的蛋白濃度為24.32 mg/mL,純化后的腹水蛋白濃度為0.72 mg/mL,通過SDS-PAGE檢測腹水純化效果,結果表明腹水純化效果良好。藥物交叉試驗結果顯示,該AA單克隆抗體恩諾沙星、頭孢氨芐、四環(huán)素、環(huán)丙沙星、BSA和OVA無明顯的交叉反應,與安乃近交叉反應率為86.3%,與安乃近代謝產(chǎn)物4-甲氨基安替比林的交叉反應率為79.1%。3.ELISA檢測方法的建立優(yōu)化ELISA檢測方法中的各項條件,確定2%明膠溶液為最佳封閉液,抗原抗體最佳工作濃度分別為1:3000和1:16000。ELISA標準抑制曲線線性方程為y=0.2894x-0.1085,相關系數(shù)R2=0.995,AA藥品濃度在10～5000 ng/mL時線性關系良好,經(jīng)過相關數(shù)據(jù)的計算得出:藥物的 IC50為 120.79 ng/mL,LOD 為 7.1 ng/mL,LOQ 為 51.76 ng/mL。4.豬肉中AA添加回收試驗本試驗設置豬肉樣品并通過相關步驟對豬肉樣品進行前處理,樣品溶液稀釋16倍時可以排除樣品基質的干擾。通過競爭抑制曲線的繪制可以看出藥物濃度在20～2000 ng/mL時線性關系良好,線性回歸方程為y=0.3489x-0.2311,相關系數(shù)R2=0.9907,藥物半數(shù)抑制濃度 IC50 為 124.58 ng/mL,LOD 為 9.52 ng/mL,LOQ 為 22.68 ng/mL。設置三個藥品濃度梯度分別為50 ng/mL、400 ng/mL和800 ng/mL進行添加回收試驗,最后計算出豬肉樣品中4-氨基安替比林的添加回收率在87.70%～101.57%。
【圖文】：

圖２－１戊二醛法制備人工抗原路線逡逑Ｆｉｇ．邋２－１邋Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ邋ｓｃｈｅｍｅ邋ｏｆ邋ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ邋ａｎｔｉｇｅｎ邋ｂｙ邋ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ逡逑１．５．３包被原的合成逡逑包被原的合成同１．５．２介紹的方法，將４－氨基安替比林與大分子載體蛋白ＯＶＡ進行偶逡逑聯(lián)，在最后一步加入過量的甘氨酸以封閉未反應的醛基。逡逑１．６人工抗原的分析逡逑１．６．１人工抗原蛋白濃度的測定逡逑本試驗采用ＢＣＡ法測定完全抗原ＡＡ－ＢＳＡ、ＡＡ－ＯＶＡ的蛋白濃度，方法如表２－１所示，逡逑具體實驗步驟如下：逡逑（１）按照試劑盒說明要求將蛋白溶液配制成試驗所需的標準蛋白溶液（０．５邋ｍｇ／ｍＬ），逡逑并使用標準蛋白溶液吸�。�、５、１０、２０、４０、６０、８０、１００邋ｈＬ加入到９６孔板中。逡逑（２）各孔加入ＰＢＳ溶液，每孔總體積為１００邋ｎＬ，使用移液器緩慢吹打每孔使各孔液逡逑體混合均勻。從各孔吸�。玻板澹瑁倘芤悍謩e加入到三個空白孔中。逡逑（３）將合成的人工抗原溶液稀釋成蛋白濃度為０？０．５邋ｍｇ／ｍＬ的區(qū)間內(nèi)并加入每孔２０逡逑

２結果逡逑２．１人工抗原蛋白濃度的測定結果逡逑根據(jù)試驗測得的數(shù)據(jù)繪制的標準曲線如圖２－２所示，線性方程為ｙ＝０．９５５１Ｘ－０．１１１，相逡逑關系數(shù)Ｒ２為０．９９６３，將相關數(shù)據(jù)代入公式計算得出，ＡＡ－ＢＳＡ蛋白濃度為５．７３邋ｍｇ／ｍＬ，逡逑ＡＡ－ＯＶＡ邋蛋白濃度為邋６．６１邋ｍｇ／ｍＬ。逡逑０．６邋ｒ逡逑０．５邋－邐＞逡逑＃４邋－邐ＪＴ逡逑Ｉ５邋０．邋３邋－逡逑]
邋０．２邋－邐ｙ邋＝邋0．邋９５５１Ｘ邋－邋０．邋Ｉｌｌ逡逑５邋0．邋１邋－邐ｙｒ邐Ｒ２邋＝邋０．邋９９６３逡逑０邋邐１邐■邐１邐１逡逑０．０邐０．２邐０．４邐０．６邐０．８逡逑ｏｄ邋值／Ａ逡逑圖２－２人工抗原蛋白標準曲線逡逑Ｆｉｇ．邋２－２Ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｓｔａｎｄａｒｄ邋ｃｕｒｖｅ邋ｏｆ邋ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ邋ａｎｔｉｇｅｎ逡逑
【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S859.84

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本文編號：2613866