【摘要】：研究背景結(jié)核病是一種由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)引起的,經(jīng)由呼吸道傳播的慢性傳染病,是全世界單一病原引起死亡人數(shù)最多的疾病,致死率已經(jīng)超過艾滋病。據(jù)報道,2015年新發(fā)結(jié)核病例有1040萬,結(jié)核致死人數(shù)高達(dá)180萬。因此,結(jié)核病對全球人類的健康威脅十分嚴(yán)峻,是亟待解決的全球性公共衛(wèi)生問題。MTB是一種兼性細(xì)胞內(nèi)寄生菌,入侵機(jī)體后主要寄居于宿主巨噬細(xì)胞(macrophage,Mφ)。作為結(jié)核感染的第一道防線,巨噬細(xì)胞表達(dá)多種模式識別受體,其中,TLRs是介導(dǎo)宿主對結(jié)核分枝桿菌的識別及抗結(jié)核免疫反應(yīng)的關(guān)鍵分子。MTB通過TLR被Mφ識別后,一方面,Mφ可被誘導(dǎo)產(chǎn)生一系列促炎因子,構(gòu)建炎性微環(huán)境,發(fā)揮抗菌效應(yīng);另一方面,促進(jìn)殺菌的炎癥反應(yīng)同時也是導(dǎo)致病理損傷的機(jī)制。宿主無論是處于潛伏期還是活動期,結(jié)核病所表現(xiàn)出的核心病理特征均體現(xiàn)為過度失調(diào)的炎癥反應(yīng)。因此,對于MTB感染誘導(dǎo)的Mφ炎癥反應(yīng)的調(diào)控是控制結(jié)核病發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。β-arrestin 2是TLR/IL-1R信號下游至關(guān)重要的免疫激活負(fù)調(diào)節(jié)器,能調(diào)控MAPK、NF-κB等信號通路的效應(yīng),而MAPK通路是參與抗MTB天然免疫的TLR下游關(guān)鍵信號通路。ERK1/2作為MAPK家族的成員之一,介導(dǎo)多種影響MTB感染結(jié)局的效應(yīng),從而受到廣泛關(guān)注。因此,本研究主要著眼于β-arrestin 2對ERK1/2通路的調(diào)控。泛素化修飾對β-arrestin 2調(diào)控信號通路的效應(yīng)至關(guān)重要。已有多項研究發(fā)現(xiàn),β-arrestin 2泛素化是其發(fā)揮ERK1/2支架蛋白活性,介導(dǎo)受體內(nèi)吞所必須的。然而,MTB感染Mφ中β-arrestin 2泛素化修飾對TLR下游ERK1/2通路的調(diào)控尚未見報道。本課題首次探討了這一問題,發(fā)現(xiàn)沉默E3泛素連接酶Mdm2的表達(dá),可顯著抑制卡介苗(bacillus calmette-guerin,BCG)感染后β-arrestin 2依賴的、ERK1/2調(diào)控的促炎細(xì)胞因子表達(dá)。可見,β-arrestin2泛素化與ERK1/2信號通路在結(jié)核感染中的效應(yīng)息息相關(guān)。本課題探究了 β-arrestin 2通過調(diào)控ERK1/2通路調(diào)節(jié)MTB感染Mφ的炎癥免疫應(yīng)答的效應(yīng)與機(jī)制,并初步探討了 β-arrestin 2泛素化在此過程中的調(diào)節(jié)作用。通過探究上述機(jī)制,有助于開發(fā)通過β-arrestin 2精準(zhǔn)調(diào)控MAPK通路的抗結(jié)核藥物,對結(jié)核病防治具有重要意義。研究內(nèi)容1.檢測MTB對Mφ中β-arrestin 2的表達(dá)調(diào)控效應(yīng),以及β-arrestin 2對Mφ抑菌活性的調(diào)節(jié)作用;2.檢測β-arrestin 2對MTB感染的Mφ中炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用;3.探討β-arrestin 2調(diào)節(jié)Mφ炎癥反應(yīng)及抑菌效應(yīng)的分子機(jī)制。研究方法1.檢測MTB對Mφ中β-arrestin 2的表達(dá)調(diào)控效應(yīng),以及β-arrestin 2對Mφ抑菌活性的調(diào)節(jié)作用1)采用實時熒光定量PCR與Western blot,檢測MTB感染Mφ中β-arrestin 2的mRNA與蛋白表達(dá)水平;2)通過平板菌落計數(shù)實驗,檢測沉默β-arrestin 2后MTB感染Mφ的抑菌活性。2.檢測β-arrestin 2對MTB感染的Mφ中炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用采用實時熒光定量PCR與Luminex技術(shù)檢測沉默β-arrestin 2后MTB感染Mφ的促炎因子與抗炎因子表達(dá)。3.探討β-arrestin 2調(diào)節(jié)Mφ炎癥反應(yīng)及抑菌效應(yīng)的分子機(jī)制1)U0126抑制ERK1/2通路后,實時熒光定量PCR檢測β-arrestin 2表達(dá)沉默對MTB感染Mφ促炎因子表達(dá)的調(diào)節(jié)效應(yīng);2)Western blot檢測沉默β-arrestin 2后MTB感染Mφ的ERK1/2通路活化;3)免疫熒光-激光掃描共聚焦顯微鏡觀察MTB感染Mφ中,β-arrestin 2與p-ERK1/2共定位與轉(zhuǎn)位;4)免疫共沉淀檢測MTB感染Mφ中β-arrestin 2與ERK1/2通路蛋白的結(jié)合,以及β-arrestin 2的泛素化修飾;5)實時熒光定量PCR檢測Mdm2表達(dá)沉默對MTB感染Mφ的細(xì)胞因子表達(dá)調(diào)節(jié)。結(jié)果1.β-arrestin 2 mRNA表達(dá)水平在感染后Mφ中先下調(diào)、后上升;相反,β-arrestin 2蛋白表達(dá)水平逐漸提高,至感染后72 h開始下調(diào);β-arrestin 2表達(dá)被沉默后,促進(jìn)了 Mφ的抑菌活性。2.沉默β-arrestin 2表達(dá)后,BCG感染THP-1-Mφ的促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6表達(dá)水平顯著上升,而抗炎因子IL-10、TGF-β在THP-1-Mφ與原代Mφ的變化則存在不同。β-arrestin 2對促炎因子表達(dá)的調(diào)節(jié)效應(yīng)與其對Mφ抑菌活性的調(diào)節(jié)效應(yīng)一致,提示其通過調(diào)節(jié)促炎因子表達(dá)而發(fā)揮調(diào)節(jié)Mφ抑菌活性的效應(yīng)。3.抑制ERK1/2通路后,可逆轉(zhuǎn)β-arrestin2表達(dá)沉默對促炎因子表達(dá)的促進(jìn)效應(yīng)。β-arrestin 2表達(dá)沉默不改變BCG感染THP-1-Mφ中ERK1/2通路的活化水平,但內(nèi)源性β-arrestin2可抑制p-ERK1/2的核轉(zhuǎn)位。同時,BCG的感染能促進(jìn)β-arrestin 2與p-ERK1/2、p-TPL2的結(jié)合,使β-arrestin 2泛素化水平增加。與此相一致,沉默E3泛素連接酶Mdm2表達(dá)與沉默β-arrestin 2對促炎因子表達(dá)的調(diào)節(jié)效應(yīng)相似。結(jié)論β-arrestin 2在MTB感染Mφ中表達(dá)上調(diào),并參與調(diào)節(jié)MTB誘導(dǎo)的ERK1/2核轉(zhuǎn)位,由此調(diào)控被感染Mφ炎癥反應(yīng)及抑菌活性;該過程中,β-arrestin 2泛素化水平上調(diào),抑制泛素化則增強(qiáng)ERK1/2通路的轉(zhuǎn)錄調(diào)控效應(yīng)。
【圖文】：

測Ｐ－ａｒｒｅｓｔｉｎ２的表達(dá)，結(jié)果顯示，Ｐ－ａｒｒｅｓｔｉｎ２ｍＲＮＡ表達(dá)水平在感染后Ｍ（ｐ中先Ｋ調(diào)、逡逑后上升，但感染Ｈ３７Ｒｖ較感染ＢＣＧ更早表現(xiàn)出上升趨勢；相反，Ｐ－ａｒｒｅｓｔｉｎ２蛋白表達(dá)逡逑水平隨感染時間延長而逐漸提高，，至感染后７２邋ｈ才開始下調(diào)（圖３－１）。與此同時，分逡逑離健康志愿者ＰＢＭＣ，采用免疫磁珠法分選ＣＤ１４＋單核細(xì)胞，添加ＧＭ－ＣＳＦ誘導(dǎo)其向逡逑Ｍｃｐ分化。得到成熟的原代Ｍ（ｐ后，采取與ＴＨＰ－ｈＭｔｐ同樣的處理方法感染并檢測逡逑（３－ａｒｒｅｓｔｉｎ２的表達(dá)。結(jié)果顯示，兩種細(xì)胞中ｐ－ａｒｒｅｓｔｉｎ２的表達(dá)變化相似（圖３－２）。逡逑Ａ邋１５邐Ｂ逡逑＿ＴＨＰ－１＋ＢＣＧ逡逑２邐ｒ邐ＴＨＰ－１邋ＢＣＧ邋（ＭＯＩ＝５）逡逑ｃｍ邋１．０邋．邋＿邐■邐邐：邐：——逡逑？￡邐■邐■邐０邐６邐２４邋４８邋７２邋（ｈ）逡逑婭。．５邋■邋■邋＿邋■邋■邋Ｐａｒｒ２邐逡逑、ｉｎｕｉ邋邐邐逡逑０邋６邋２４邋４８邋７２逡逑Ｈｏｕｒｓ邋ｐｏｓｔ邋ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ逡逑Ｃ邋２．５邋■ＴＨＰ－１＋Ｈ３７ＲＶ邐Ｄ逡逑琶邋２邋0邐＿邐ＴＨＰ－１邋Ｈ３７Ｒｖ邋（ＭＯＩ＝５）逡逑．￡邋１，５邋＇邐＿邋■邐０邐６邋２４邋４８邋７２邋（ｈ）逡逑簽邋１．０邋．邋＿邐．邋■邋■邋ｐａｒｒ２邐．＿Ｐ邋丨＿，逡逑１１，１１１邋—邐逡逑０邋６邋２４邋４８邋７２逡逑Ｈｏｕｒｓ邋ｐｏｓｔ邋ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ逡逑圖３－１？實時熒光定量ＰＣＲ與Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂ丨ｏｔ檢測ＭＴＢ感染ＴＨＰ－１－Ｍ＜ｐ中ｐ－ａｒｒｅｓｔｉｎ２的表達(dá)逡逑Ｆｉｇ邋３－１．邋Ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｏｆ邋Ｐ－ａｒｒｅｓｔ

Ｈｏｕｒｓ邋ｐｏｓｔ邋ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ邐Ｈｏｕｒｓ邋ｐｏｓｔ邋ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ逡逑圖３－６．實時熒光定量ＰＣＲ與Ｌｕｍｉｎｅｘ檢測沉默ｐ－ａｒｒｅｓｔｉｎ邋２表達(dá)對ＢＣＧ感染原代Ｍ＜ｐ中逡逑促炎因子表達(dá)的調(diào)節(jié)逡逑Ｆｉｇ邋３－６．邋Ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｏｆ邋ｐｒｏ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ邋ｃｙｔｏｋｉｎｅ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｂｙ邋Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ邋Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ邋ＲＴ－ＰＣＲ邋ｉｎ逡逑ＢＣＧ－ｉｎｆｅｃｔｅｄ邋ｈｕｍａｎ邋ｐｒｉｍａｒｙ邋Ｍｃｐ邋（ＭＯＩ＝５）邋ａｆｔｅｒ邋ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ邋ｐ－ａｒｒｅｓｔｉｎ邋２逡逑Ａ．ＴＮＦ－ａ的ｍＲＮＡ表達(dá)；Ｂ．邋ＩＬ－ｌｐ的ｍＲＮＡ表達(dá)；Ｃ．邋ＩＬ－６的ｍＲＮＡ表達(dá)；逡逑Ｄ．ＴＮＦ－ａ的蛋白表達(dá)；Ｅ．邋ＩＬ－１（３的蛋白表達(dá)（＊Ｐ＜０．０５）逡逑３．２．３邋沉默ｐ－ａｒｒｅｓｔｉｎ邋２后ＭＴＢ感染Ｍｔｐ的抗炎因子表達(dá)檢測逡逑采用脂質(zhì)體法將ｓｉＲＮＡ轉(zhuǎn)染進(jìn)ＴＨＰ－ｈＭｃｐ以沉默Ｐ－ａｒｒｅｓｔｉｎ邋２表達(dá)，轉(zhuǎn)染２４邋ｈ后按逡逑ＭＯＩ＝５對ＴＨＰ－１－Ｍｃｐ感染ＢＣＧ邋６ｈ，實時熒光定量ＰＣＲ檢測抗炎因子ＩＬ－１０、ＴＧＦ－Ｐ逡逑３８逡逑
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R52

【參考文獻(xiàn)】

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1 王黎霞;成詩明;陳明亭;趙雁林;張慧;姜世聞;何廣學(xué);呂青;杜昕;陳偉;劉小秋;阮云洲;王勝芬;夏aa;于蘭;李峻;李雪;;2010年全國第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查報告[J];中國防癆雜志;2012年08期

本文編號：2585028