【摘要】：目的:克隆人特異性抗蛋白酶保護(hù)因子 Elafin 基因 cDNA,構(gòu)建該基因的真核表達(dá)載體;觀察其在肺上皮細(xì)胞中的表達(dá)情況,為研究Elafin 作為天然內(nèi)生抗菌多肽的應(yīng)用提供技術(shù)基礎(chǔ)。 方法:(1)抽提人肺總 RNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),經(jīng) PCR 擴(kuò)增目的片段,將其克隆于 pUCm-T 載體上,經(jīng)酶切電泳、DNA 測(cè)序鑒定分析;定向亞克隆到綠色熒光蛋白表達(dá)載體 pEGFP-N1,并經(jīng)酶切電泳、DNA 測(cè)序鑒定分析構(gòu)建是否成功。(2)將 pEGFP-N1-elafin 轉(zhuǎn)染到肺上皮細(xì)胞 A549 中,熒光顯微鏡觀察其在細(xì)胞中表達(dá)及定位,并采用特異的cRNA 探針和抗 Elafin 單抗行 Northern 雜交和 ELISA 檢測(cè),分別從轉(zhuǎn)錄及蛋白質(zhì)水平來(lái)分析其表達(dá)情況。 結(jié)果:(1)經(jīng) RT-PCR 獲得 377bp 的產(chǎn)物,經(jīng)酶切、DNA 測(cè)序,確定所擴(kuò)增片段為人 Elafin 基因 cDNA,進(jìn)而成功篩選出表達(dá)載體pEGFP-N1-elafin。(2)轉(zhuǎn)染后的肺上皮細(xì)胞中有 Elafin 基因表達(dá),同時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)上清液檢測(cè)到 Elafin。 結(jié)論:獲得編碼 Elafin 的基因片段,并成功構(gòu)建了真核表達(dá)載體pEGFP-N1-elafin。在其轉(zhuǎn)染的肺上皮細(xì)胞中有 Elafin 基因表達(dá),且證實(shí)其主要是由培養(yǎng)細(xì)胞呈分泌性表達(dá)。Elafin 基因 cDNA 真核表達(dá)載體的成功構(gòu)建以及主要呈分泌性表達(dá)的特點(diǎn)顯示了極具意義的潛在應(yīng)用價(jià)值。
[Abstract]:Aim: to construct the eukaryotic expression vector of human specific antiprotease protective factor (Elafin) gene cDNA, and observe its expression in pulmonary epithelial cells, and to provide a technical basis for the study of Elafin as a natural endophytic antibacterial peptide. Methods: (1) the total RNA of human lung was extracted for reverse transcription reaction. The target fragment was amplified by PCR and cloned into pUCm-T vector. It was identified by enzyme digestion electrophoresis and DNA sequencing. The expression vector of green fluorescent protein (pEGFP-N1,) was subcloned into GFP expression vector and analyzed by restriction endonuclease electrophoresis and DNA sequencing. (2) pEGFP-N1-elafin was transfected into lung epithelial cell line A549. Fluorescence microscopy was used to observe its expression and localization in cells. Northern hybridization and ELISA detection were performed with specific cRNA probe and anti Elafin monoclonal antibody to analyze its expression at the level of transcription and protein respectively. Results: (1) the product of 377bp was obtained by RT-PCR. The amplified fragment of human Elafin gene cDNA, was confirmed by restriction endonuclease digestion and DNA sequencing, and then the expression vector pEGFP-N1-elafin. (2) was successfully screened for Elafin gene expression in the transfected pulmonary epithelial cells. Elafin. was detected in the supernatant of cell culture at the same time. Conclusion: the gene fragment encoding Elafin was obtained and the eukaryotic expression vector pEGFP-N1-elafin. was successfully constructed. Elafin gene was expressed in the transfected lung epithelial cells. The successful construction of eukaryotic expression vector of Elafin gene cDNA and the characteristic of mainly secretory expression showed the potential value of application.
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2005
【分類號(hào)】：R346

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2347418