【摘要】： 目的構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-6p-2/Foxp3,并轉(zhuǎn)化至表達宿主菌E.coli BL21(DE3)中誘導表達,以純化蛋白為抗原免疫新西蘭兔制備抗小鼠Foxp3的多克隆抗體,對抗體進行滴度及特異性的分析。以制備的抗體為一抗Western-blot檢測小鼠1型糖尿病模型脾細胞中Foxp3的表達情況,為進一步研究Foxp3奠定了基礎(chǔ)。 方法(1)小鼠Foxp3重組蛋白的表達、純化和多抗制備軟件分析小鼠Foxp3基因,選取第532～1008bp位堿基序列為目的基因,其編碼產(chǎn)物159aa具有強抗原性及高特異性。以pMIGR1/ Foxp3重組質(zhì)粒為模板,PCR擴增目的片斷,將目的片斷克隆至原核表達載體pGEX-6p-2,構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-6p-2/Foxp3,經(jīng)酶切、PCR及測序鑒定后轉(zhuǎn)化至表達宿主菌E.coli BL21(DE3)中誘導表達,SDS-PAGE和Western-Blot鑒定表達產(chǎn)物;對重組融合蛋白(目的蛋白和GST蛋白)進行大量誘導表達,用GST瓊脂糖凝膠FF純化柱純化,SDS-PAGE和Western-Blot分析和鑒定純化蛋白,采用BCA試劑盒測定純化蛋白濃度;用純化的重組融合蛋白免疫新西蘭兔,制備抗血清;采用ELISA法測定抗血清效價;利用脂質(zhì)體法分別轉(zhuǎn)染pMIGR1/Foxp3及pMIGR1入NIH3T3細胞,提取轉(zhuǎn)染細胞的總蛋白,以制備的多抗為一抗進行Western-blot法檢測NIH3T3轉(zhuǎn)染細胞表達的Foxp3,對制備的多抗進行特異性分析。(2) Foxp3在小鼠1型糖尿病模型中的表達研究用STZ誘導小鼠1型糖尿病模型,嚴密觀察飲食情況,定期稱體重,測量尿糖及血糖變化,制作胰腺、胃黏膜及甲狀腺組織的病理切片以觀察其病理改變;流式細胞術(shù)檢測脾細胞中CD4+T細胞和CD4+CD25+T細胞數(shù)量的變化;RT-PCR、半定量Western-blot分別在mRNA、蛋白水平檢測小鼠脾細胞中Foxp3的表達。 結(jié)果PCR擴增得到長477bp的目的片斷;構(gòu)建的重組質(zhì)粒pGEX-6p-2/Foxp3經(jīng)酶切、PCR和測序鑒定證明其中插入片段為目的基因;含pGEX-6p-2/Foxp3重組菌經(jīng)IPTG誘導,SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示,得到一分子量約45kDa的重組融合蛋白GST-Foxp3,用GST瓊脂糖凝膠FF純化柱對重組融合蛋白進行純化;Western-blot鑒定誘導表達的蛋白及純化蛋白能被抗GST單抗識別,在45kDa附近有特異條帶,與預(yù)期融合蛋白大小一致;以純化的Foxp3重組融合蛋白為抗原免疫新西蘭兔制備抗Foxp3抗體,ELISA法檢測所得抗體效價在1∶1 2 800以上,Western-blot結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染pMIGR1/Foxp3的NIH3T3細胞總蛋白能被抗小鼠Foxp3多抗特異性識別,而轉(zhuǎn)染pMIGR1的NIH3T3細胞總蛋白未出現(xiàn)任何條帶;STZ誘導的小鼠1型糖尿病模型組與正常組及對照組相比,有明顯的多飲、多食、多尿和體重減輕等典型的糖尿病表現(xiàn);模型鼠在造模1月后出現(xiàn)不同程度的尿糖改變,血糖水平也顯著升高,胰島有不同程度的胰島炎性改變,而其它兩組尿糖均陰性,血糖水平正常,胰島未發(fā)生病理改變;流式分析T淋巴細胞亞群在小鼠脾細胞中的比例在各組之間變化明顯,用STZ致誘小鼠糖尿病后,CD4+T細胞顯著升高,而CD4+CD25+T細胞在模型組小鼠脾細胞中的比例也較正常組及對照組稍有升高,但是模型組CD4+CD25+T與CD4+T細胞的比值較正常組及對照組顯著偏低;RT-PCR檢測小鼠脾細胞中Foxp3 mRNA的表達水平,模型組小鼠的脾細胞中Foxp3 mRNA的表達與內(nèi)參(G3PDH)的比稍高于正常組及對照組;半定量Western-blot結(jié)果顯示模型組的脾細胞中Foxp3在蛋白水平的表達量亦稍高于正常組及對照組。 結(jié)論 (1)成功構(gòu)建了pGEX-6p-2/Foxp3原核表達載體,其在大腸桿菌BL21(DE3)中表達出一分子量約為45kDa的重組融合蛋白; (2)誘導表達的重組融合蛋白具有較好的免疫原性,能刺激新西蘭兔產(chǎn)生高效價的特異性抗體; (3)小鼠1型糖尿病模型中Foxp3的表達量稍升高,仍不能使CD4+CD25+Treg與CD4+T細胞的比值保持平衡而來抑制效應(yīng)性CD4+T細胞的增殖。
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【學位授予單位】：南華大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R587.1;R392

【參考文獻】

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1 譚志平,黃亮群,鄭多,房海燕,夏昆,夏家輝;p11融合蛋白表達、純化及抗血清的制備[J];湖南醫(yī)科大學學報;2002年03期

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本文編號：2347730