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神經(jīng)干細胞共移植體體外構建的實驗研究

發(fā)布時間:2018-11-21 13:44
【摘要】: 目的:通過實驗篩選合適的細胞外基質(zhì),利用腦微血管內(nèi)皮細胞(vascular endothelial cells VECs)、細胞外基質(zhì)與神經(jīng)干神胞(neural stem cells NSCs)共同構建神經(jīng)干細胞共移植體,以提高移植神經(jīng)干細胞存活和定向分化為神經(jīng)元,減少其凋亡。 方法:實驗分為兩個部分。一是利用無血清培養(yǎng)和細胞克隆培養(yǎng)技術,從新生Wistar大鼠(1-3d)海馬分離NSCs,進行體外擴增培養(yǎng)、傳代,采用免疫組織化學法和熒光法做nestin染色鑒定;利用M199培養(yǎng)基,從新生1-7d Wistar大鼠大腦中分離腦微血管內(nèi)皮細胞,進行體外擴增培養(yǎng),采用免疫細胞化學方法鑒定;選用不同的細胞外基質(zhì)包括多聚賴氨酸(poly-L-Lysine),層粘連蛋白(LN)、Matrigel與兩種細胞進行貼壁共培養(yǎng),鏡下觀察與三組細胞外基質(zhì)共培養(yǎng)NSCs的存活、增殖、分化情況;采用免疫細胞化學方法觀察不同時間點(3d、7d、14d)NSCs定向分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞情況及NSCs增殖、凋亡情況。二是NSCs共移植體構建及檢測:將傳代的腦微血管內(nèi)皮細胞用0.25%胰酶消化20min后,以3×10~7L~(-10的密度接種在培養(yǎng)瓶中,12h貼壁后吸出腦微血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)液,涂以一層細胞外基質(zhì)后,接種經(jīng)0.125%胰酶消化20 min后吹打成單細胞NSCs懸液,密度為6×10~8L~(-1),加入NSCs完全培養(yǎng)液。培養(yǎng)3-6h鏡下觀察NSCs完全貼壁后,吸出培養(yǎng)液,再涂以一薄層細胞外基質(zhì),再接種以上相同密度的腦微血管內(nèi)皮細胞,加入NSCs完全培養(yǎng)液,共培養(yǎng)12-24h,形成分層結構(VECs-細胞外基質(zhì)-NSCs-細胞外基質(zhì)-VECs),經(jīng)適力吹打形成NSCs共移植體,利用免疫熒光的方法,以Ⅷ因子標記物標記腦微血管內(nèi)皮細胞,用nestin標記NSCs,檢測共移植體。將不同基質(zhì)構建的共移植體接種于放有蓋玻片的六孔板中,加入神經(jīng)干細胞培養(yǎng)液,在3d、7d、14d鏡下觀察共移植體的生長情況。 結果: 1、NSCs和VECs形態(tài)學觀察及鑒定:原代分離的單NSC 4d增生為神經(jīng)細胞球,傳代后,經(jīng)nestin免疫熒光染色,細胞球呈陽性;原代培養(yǎng)腦微血管內(nèi)皮細胞6-8d長滿瓶壁,細胞呈多角形或扁平梭形,核卵圓形,VIII因子相關抗原陽性。 2、三種細胞外基質(zhì)對NSCs分化影響:3d時MAP2免疫組化陽細胞數(shù),由層粘連蛋白參與的共培養(yǎng)明顯高于由Matrigel、多聚賴氨酸參與的共培養(yǎng)(P0.05);7d時差距更加明顯(P0.01);14d時LN組高于Matrigel組差距不時顯,且兩者明顯高于多聚賴氨酸組(P0.01)。3d時GFAP免疫組化陽細胞數(shù),由層粘連蛋白參與的共培養(yǎng)高于由Matrigel、多聚賴氨酸參與的共培養(yǎng)(P0.05),7d時三組差距不明顯,14d時多聚賴氨酸組和Matrigel組差距不明顯,但兩者明顯高于LN組(P0.05)。3d、7d、14d時,GFAP+ MAP_2免疫組化陽細胞數(shù),由層粘連蛋白參與的共培養(yǎng)明顯高于由Matrigel、多聚賴氨酸參與的共培養(yǎng)(P0.01) 3、LN的細胞粘附性較好,兩種細胞參與共建細胞數(shù)較高,共移植體平均細胞數(shù)8-15個,平均共移體直徑28μm,較合適體內(nèi)移植。 4、共培養(yǎng)中神經(jīng)干細胞的增殖和凋亡的檢測:隨著天數(shù)的增加,神經(jīng)干細胞數(shù)也隨之增加,但3d時,LN組和Matrigel組Brdu陽性細胞數(shù)明顯高于多聚賴氨酸組(P0.05),7d時Brdu陽性細胞數(shù)各組均增多,但LN組和Matrigel組Brdu陽性細胞數(shù)明顯高于多聚賴氨酸組(P0.01),14d時各組細胞增殖明顯,LN組和Matrigel組Brdu陽性細胞數(shù)明顯高于多聚賴氨酸組(P0.01);在三個時間點(3d、7d、14d)可見LN組和Matrigel組Caspase/Brdu雙陽性細胞數(shù)明顯低于多聚賴氨酸組。 5、共移植體活細胞鏡下所見及免疫熒光結果:通過分層貼壁共培養(yǎng)和適力吹打可以形成LN、VECs和NSCs特征性結構。這種結構以VECs和NSCs緊密相貼或VECs半包NSCs為等征。鏡下可見共移植體細胞團不規(guī)則,NSCs被腦微血管內(nèi)皮細胞包繞或相互連貼,腦微血管內(nèi)皮細胞細胞核大,胞體不規(guī)則,明顯大于NSCs,NSCs折光性強。在200倍視野下,隨機選取100個共移植體進行細胞計數(shù),可見平均細胞數(shù)為8-15個,其中腦微血管內(nèi)皮細胞數(shù)平均2.8個。免疫熒光可見紅色VIII因子陽性VECs包被綠色nestin陽性NSCs,或相互粘貼。 結論: 1.層粘連蛋白具有良好的細胞粘附性,可使神經(jīng)干細胞與腦微血管內(nèi)皮細胞間很好的粘附,可形成大小適中的神經(jīng)干細胞共移植體。 2.層粘連蛋白較多聚賴氨酸和Matrigel有更好的促進神經(jīng)干細胞分化的能力,并誘導其定向分化為神經(jīng)元;從而使神經(jīng)干細胞分化為膠質(zhì)細胞數(shù)較少,有利于共移植體植入體內(nèi)發(fā)揮神經(jīng)替代作用。 3.層粘連蛋白能提高神經(jīng)干細胞存活,促進神經(jīng)干細胞的增殖和內(nèi)皮細胞增殖,并通過內(nèi)皮細胞間接地促進神經(jīng)干細胞增殖。 4.層粘連蛋白較多聚賴氨酸和Matrigel有更好地促進神經(jīng)干細胞分化時軸突生長的作用,并且可促進神經(jīng)干細胞的遷移。 5.層粘連蛋白是構建神經(jīng)干細胞共移植體較理想的細胞外基質(zhì),以腦微血管內(nèi)皮細胞為支持細胞,以層粘連蛋白為細胞外基質(zhì),經(jīng)分層立體共培養(yǎng)(VECs-LN-NSCs-LN-VECs),適力吹打可以成功構建適合體內(nèi)移植的神經(jīng)干細胞共移植體。
[Abstract]:......
【學位授予單位】:佳木斯大學
【學位級別】:碩士
【學位授予年份】:2007
【分類號】:R329

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