[目的]分析rab7及其下游相關(guān)分子rilp和rep1在卡介苗侵襲巨噬細胞過程中的作用。[方法]利用CRISPRERA在線設(shè)計鼠源rab7-gRNA序列,構(gòu)建dCas9調(diào)控質(zhì)粒,比較調(diào)控前后rab7、rilp和rep1的mRNA表達量。[結(jié)果]成功設(shè)計3條rab7-gRNA,構(gòu)建重組調(diào)控質(zhì)粒p X330S-2-d Cas9-gRNA-T2A-EGFP; BCG感染后,巨噬細胞內(nèi)rab7及其下游的rilp和rep1的mRNA水平明顯上升（P ＜0. 01）; gRNA1調(diào)控后,rab7及下游rilp的mRNA水平明顯下降（P ＜0. 05; P ＜0. 01）; gRNA3調(diào)控后,rab7及rilp mRNA水平有所下降,但無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞ 0. 05）。gRNA1和gRNA3調(diào)控對rep1 mRNA水平無明顯影響（P＞ 0. 05）。[結(jié)論]在BCG侵染巨噬細胞過程中,rab7作為晚期吞噬體的標志受到dCas9調(diào)控后變化明顯,rilp作為rab7的下游效應(yīng)分子,表達水平與rab7的變化一致,而rep1未見明顯變化。三者在MTB寄生過程中的作用還有待深入研究。 

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【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 材料
        1.1.1 實驗材料
        1.1.2 試劑
        1.1.3 儀器
    1.2 方法
        1.2.1 gRNA設(shè)計及重組載體構(gòu)建
        1.2.2 小鼠巨噬細胞Raw264.7的培養(yǎng)及轉(zhuǎn)化
        1.2.3 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Raw264.7 的單克隆篩選及卡介苗侵染
        1.2.4 rab7、rilp、rep1 mRNA的表達情況
        1.2.5 數(shù)據(jù)分析
2 結(jié)果與分析
    2.1 gRNA預(yù)測與載體構(gòu)建
    2.2 dCas9-rab7重組質(zhì)粒驗證
    2.3 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化巨噬細胞
    2.4 gRNA調(diào)控后rab7及下游rilp、rep1基因mR-NA表達情況
3 討論


【參考文獻】：
期刊論文
[1]CRISPR-dCas9調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的研究進展[J]. 田開仁,薛二淑,宋倩倩,喬建軍,李艷妮.  中國生物工程雜志. 2018(07)



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