發(fā)布時間：2017-04-30 05:17

  本文關鍵詞：Martentoxin的表達體系優(yōu)化及其與BK通道孔區(qū)的交互結構模擬，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：大電導鈣激活(large-conductance Ca2+-activated K+channel,BK)鉀通道是廣泛分布于興奮性和非興奮性細胞中的一種受電壓和鈣離子雙重門控的鉀離子通道,具有調(diào)節(jié)細胞興奮性、控制細胞增殖遷移和滲透壓等生理功能。Martentoxin源于我國獨有產(chǎn)毒物種東亞鉗蝎(Buthus martensi Karsch,Bm K),是一種由37個氨基酸殘基構成的短鏈多肽毒素。研究表明,Martentoxin對BK通道的藥理選擇性高于其它各類型的電壓門控鉀通道(Kv)近千倍。迄今為止,BK通道亞型特異性藥物工具仍極度稀缺,闡明Martentoxin與BK通道間的相互作用模式將有助深入剖析BK通道結構與功能及相關病理學成因的分子機制。本論文工作借助分子生物學和計算機模擬方法,1、針對Martentoxin原核表達,選用了不同的5種表達載體以及5種感受態(tài)菌株進行多重組合優(yōu)選,并針對誘導溫度、誘導時間、誘導物濃度、親和時間以及載量等表達條件進行了分類篩選,優(yōu)選出的表達條件為:以p GEX-4T-3為載體,以Rosetta菌株為宿主菌,誘導溫度為16度,誘導時間24h,誘導物濃度0.5 m M,每升菌液3小時與1 ml填料的親和;2、選用適合通道體外表達的載體p QE30系統(tǒng),以來源于原核生物變鉛青鏈霉菌(Streptomyces lividans)鉀通道Kcs A為分子骨架,構建了包含BK通道離子透過孔區(qū)微結構的Kcs A-BK膜蛋白嵌合體,并在M15菌株大腸桿菌表達系統(tǒng)中實現(xiàn)了高效表達。運用Discovery Studio計算機模擬,對BK通道孔區(qū)進行了建模優(yōu)化及評估。本論文研究結果為探究BK通道藥物作用新靶點以及設計相關通道疾病治療藥物墊鋪了特異探針的保障前提、方法學的基礎與理論拓展的空間。
【關鍵詞】：大電導鈣激活鉀通道 Martentoxin KcsA-BK 體外表達體系優(yōu)選 計算機模擬
【學位授予單位】：上海大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R363;Q78
【目錄】：

• 摘要6-7
• ABSTRACT7-12
• 第一章 緒論12-20
• 1.1 鉀離子通道簡介12-14
• 1.2 BK通道的研究進展14-15
• 1.3 短鏈蝎毒素的研究進展15-18
• 1.4 Martentoxin：特異性神經(jīng)型BK通道阻斷劑18-19
• 1.5 本課題的研究意義19-20
• 第二章 Martentoxin表達及純化體系的優(yōu)化20-49
• 2.1 材料20-26
• 2.1.1 實驗材料與試劑20-21
• 2.1.2 實驗儀器與設備21-22
• 2.1.3 主要實驗用液配方22-26
• 2.2 方法26-35
• 2.2.1 表達載體的構建26-30
• 2.2.2 Martentoxin的表達及純化30-34
• 2.2.3 r Martentoxin的藥理學活性檢測34-35
• 2.3 結果35-47
• 2.3.1 載體的構建35-37
• 2.3.2 五種載體的比較篩選37-39
• 2.3.3 Martentoxin的表達條件39-42
• 2.3.4 Martentoxin的親和層析柱分離42-44
• 2.3.5 目的蛋白Martentoxin的分離純化44-45
• 2.3.6 r Martentoxin在LB和M9培養(yǎng)基中的提純并比較45-46
• 2.3.7 Martentoxin藥理活性的檢測46-47
• 2.4 討論47-49
• 第三章 BK通道孔區(qū)的結構模擬49-63
• 3.1 材料49
• 3.2 方法49-52
• 3.2.1 p QE30-Kcs A-BK表達質(zhì)粒的構建49-50
• 3.2.2 Kcs A-BK嵌合體蛋白的表達及純化50-51
• 3.2.3 表面等離子共振（SPR）51-52
• 3.3 結果52-60
• 3.3.1 Kcs A-BK的表達純化52-53
• 3.3.2 Kcs A-BK的藥理結合活性鑒定53-55
• 3.3.3 BK通道建模的序列一致性分析55-56
• 3.3.4 BK通道孔區(qū)模型的選取56-58
• 3.3.5 BK模型結構評估及優(yōu)化58-60
• 3.4 討論60-63
• 參考文獻63-67
• 作者在攻讀碩士學位期間的學術成果67-68
• 作者在攻讀碩士學位期間所參與的項目68-69
• 致謝69

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本文編號：336332