本文關(guān)鍵詞：屋塵螨Ⅰ、Ⅱ類變應(yīng)原T細(xì)胞表位融合肽疫苗的初步研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的構(gòu)建編碼屋塵螨變應(yīng)原Derp1和Derp2的T細(xì)胞表位融合肽嵌合基因的原核表達(dá)載體pET-28a(+)-T1-8并進(jìn)行大規(guī)模的誘導(dǎo)表達(dá)和純化,并對純化產(chǎn)物的特異性免疫治療效果進(jìn)行分析。 方法1)將Der p1和Der p2的8個(gè)T細(xì)胞表位用“GPGPG"序列間隔串聯(lián)為T1-8融合肽,利用DNA重組技術(shù)合成T1-8融合肽基因并插入質(zhì)粒pET-28a(+),構(gòu)建pET-28a(+)-T1-8載體,限制性內(nèi)切酶雙酶切驗(yàn)證并測序。2)將重組表達(dá)載體pET-28a(+)-T1-8轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌E.coil BL21(DE3)感受態(tài)中,菌落PCR篩選陽性克隆菌。3)用IPTG小劑量誘導(dǎo)表達(dá),優(yōu)化條件后進(jìn)行大劑量誘導(dǎo)表達(dá)并純化,SDS-PAGE和Western blot (WB)驗(yàn)證表達(dá)和純化產(chǎn)物。4)將40只BALB/c雌性小鼠隨機(jī)分為4組,分別為陰性對照組(PBS組)、陽性對照組(Asthma組)變應(yīng)原rDer p1和rDer p2混懸液治療組(rDer p1/rDer p2組)以及T1-8融合肽治療組(T1-8組)。用屋塵螨粗提取液(HDM)致敏小鼠建立哮喘模型,PBS組均以PBS緩沖液代替；兩組治療組分別于小鼠致敏第25天至27天霧化致敏前30min行背部皮下注射相應(yīng)治療蛋白；最后一次霧化激發(fā)24h后,收集各組小鼠血清、支氣管肺泡灌洗液(BALF)以及脾細(xì)胞培養(yǎng)上清(SSCC)。ELISA法檢測BALF和SSCC中特異性細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-17以及血清中變應(yīng)原特異性IgE、IgG、IgG2�？贵w水平,并行肺組織切片HE染色。 結(jié)果1)BamHI/NotI雙酶切結(jié)果以及測序結(jié)果顯示成功構(gòu)建pET-28a(+)-T1-8載體。2)菌落PCR結(jié)果顯示成功轉(zhuǎn)化至E.coil BL21(DE3)感受態(tài)中。3)SDS-PAGE以及WB驗(yàn)證表明該質(zhì)粒在大腸埃希菌BL21中成功表達(dá)。4)ELISA法檢測結(jié)果顯示,T1-8組和rDer p1/rDer p2組與Asthma組相比,BALF和SSCC中IL-4、IL-17均降低,IFN-γ、IL-10均升高,血清中特異性IgE、IgG1降低,IgG2a升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；T1-8組與rDer p1/rDer p2組相比,BALF和SSCC中IL-4、IL-17降低,IFN-γ、IL-10升高,血清中特異性IgE、IgG1降低,IgG2a升高,均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。肺組織切片觀察表明：T1-8組和rDer p1/rDerp2組肺部炎癥較Asthma組明顯減輕,且炎性細(xì)胞浸潤顯著減少,氣道上皮結(jié)構(gòu)重塑；T1-8組與rDer p1/rDer p2組相比,氣道上皮結(jié)構(gòu)與PBS組更為相近。結(jié)論成功構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET-28a(+)-T1-8并進(jìn)行了大規(guī)模表達(dá)和純化；表達(dá)的T1-8融合肽對哮喘小鼠進(jìn)行特異性免疫治療后可有效改善小鼠變態(tài)反應(yīng)性氣道及肺部炎癥,可作為屋塵螨哮喘患者特異性免疫治療的候選疫苗,以待進(jìn)一步的研究。
【關(guān)鍵詞】：屋塵螨 Der p1 Der p2 T細(xì)胞表位 特異性免疫治療
【學(xué)位授予單位】：安徽理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R384.4
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-13
• 注釋說明清單13-17
• 引言17-22
• 第一部分 Derp1/Derp2T表位融合肽基因的合成及原核表達(dá)載體的構(gòu)建、表達(dá)和純化22-49
• 1 研究內(nèi)容22-23
• 2 材料與方法23-33
• 2.1 重組基因23-24
• 2.2 質(zhì)粒與引物24
• 2.2.1 質(zhì)粒24
• 2.2.2 引物24
• 2.3 主要試劑24-26
• 2.4 主要儀器26-28
• 2.5 主要試劑的配制28-33
• 3 實(shí)驗(yàn)步驟33-41
• 3.1 重組質(zhì)粒的提取33-34
• 3.2 重組質(zhì)粒pET-28a(+)-T_(1-8)的雙酶切鑒定34
• 3.3 BL21(DE3)大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化34-35
• 3.3.1 感受態(tài)細(xì)胞的制備34
• 3.3.2 轉(zhuǎn)化34-35
• 3.4 pET28a(+)-T_(1-8)菌落PCR、篩選陽性菌及測序35-36
• 3.5 T_(1-8)融合肽的小劑量誘導(dǎo)表達(dá)36
• 3.6 T_(1-8)融合肽的SDS-PAGE分析36-37
• 3.7 T_(1-8)融合肽的大劑量誘導(dǎo)表達(dá)37
• 3.8 T_(1-8)融合肽的純化37-38
• 3.9 純化產(chǎn)物的免疫印記(western blot)分析38-39
• 3.10 改良型Bradford's法定量重組變應(yīng)原T1-8融合肽濃度39-41
• 4 結(jié)果41-47
• 4.1 質(zhì)粒pET-28a(+)-T_(1-8)的雙酶切鑒定43
• 4.2 PCR擴(kuò)增篩選陽性轉(zhuǎn)化子并測序43-44
• 4.3 T_(1-8)融合肽小劑量誘導(dǎo)表達(dá)44-45
• 4.4 T_(1-8)融合肽大劑量誘導(dǎo)表達(dá)和純化45-46
• 4.5 純化產(chǎn)物的免疫印跡(western blot)鑒定46
• 4.6 T_(1-8)融合肽濃度測定46-47
• 5 討論47-49
• 第二部分 T_(1-8)融合肽疫苗對哮喘小鼠免疫治療的效果分析49-65
• 1 研究內(nèi)容49-50
• 2 材料與方法50-52
• 2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物50
• 2.2 實(shí)驗(yàn)材料50
• 2.3 主要試劑50
• 2.4 主要試劑配制50-52
• 3 實(shí)驗(yàn)步驟52-55
• 3.1 塵螨粗提取液的制備52
• 3.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組52
• 3.3 小鼠哮喘模型的建立52
• 3.4 對哮喘小鼠進(jìn)行特異性免疫治療52-53
• 3.5 實(shí)驗(yàn)標(biāo)本取材及指標(biāo)檢測53-55
• 3.5.1 支氣管肺泡灌洗液(BALF)的收集和檢測53
• 3.5.2 血清特異性IgE、IgG_1和IgG_(2a)抗體含量的測定53
• 3.5.3 脾細(xì)胞培養(yǎng)53-54
• 3.5.4 肺組織病理切片HE染色54-55
• 4 結(jié)果55-63
• 4.1 塵螨粗提取液濃度的測定55
• 4.2 各組小鼠癥狀和體征的改變55
• 4.3 ELISA法測定支氣管肺泡灌洗液(BALF)中特異性細(xì)胞因子IL-4、IL-10、IL-17和IFN-γ的水平55-57
• 4.4 ELISA法測定血清中特異性IgE、IgG_1和IgG_(2a)的含量57-59
• 4.5 ELISA法測定脾細(xì)胞培養(yǎng)上清(SSCC)抗原特異性IL-4、IL-10、IL-17和IFN-γ的水平59-61
• 4.6 肺組織切片HE染色61-63
• 5 討論63-65
• 結(jié)論65-66
• 參考文獻(xiàn)66-74
• 致謝74-75
• 作者簡介及讀研期間主要科研成果75

【參考文獻(xiàn)】

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  本文關(guān)鍵詞：屋塵螨Ⅰ、Ⅱ類變應(yīng)原T細(xì)胞表位融合肽疫苗的初步研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：335480