本文關(guān)鍵詞：光遺傳學(xué)技術(shù)在眨眼條件反射研究中的初探，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：條件反射行為的研究歷史長(zhǎng)達(dá)一百年之久,其中眨眼條件反射行為是最簡(jiǎn)單,也是應(yīng)用最廣泛的聯(lián)合學(xué)習(xí)記憶模型之一。經(jīng)典的眨眼條件反射(Eyeblink conditioning, EBC)通常分為delay及trace兩種模式,一般而言,以外周刺激(如視覺或聽覺刺激)作為條件刺激(Conditioned Stimulus, CS)來建立眨眼條件反射模型；同時(shí),我們也發(fā)現(xiàn)一些以電刺激外周視聽信號(hào)上傳路徑所途經(jīng)(中繼)的局部腦區(qū)(或核團(tuán))作為條件刺激均成功建立了EBC的報(bào)告。已有研究提示前額葉在某些情況下參與了眨眼條件反射delay模式的建立或表達(dá)。這對(duì)傳統(tǒng)的結(jié)論----前額葉不參與delay模式提出了挑戰(zhàn),對(duì)此我們也非常感興趣,為什么在某些特殊情況下delay模式需要前額葉參與?因此,我們選擇了前額葉中分布最多的谷氨酸能神經(jīng)元作為研究靶點(diǎn)來探索谷氨酸能神經(jīng)元參與眨眼條件反射(delay模式)的神經(jīng)機(jī)制。光遺傳學(xué)技術(shù)是通過基因工程的方法將目標(biāo)光通道敏感基因包裝到相關(guān)病毒上,并將其轉(zhuǎn)染到動(dòng)物的某一類神經(jīng)元上,在完成一系列的分子生物學(xué)過程后光敏蛋白最終表達(dá)在特定細(xì)胞的細(xì)胞膜上,同時(shí)依據(jù)不同的光敏蛋白(如ChR2)的不同特性,實(shí)現(xiàn)對(duì)某一類型細(xì)胞或神經(jīng)元精確至毫秒級(jí)的高分辨率調(diào)控的一門革命性技術(shù)。由于光遺傳學(xué)的獨(dú)特優(yōu)勢(shì),光遺傳學(xué)為我們驗(yàn)證delay-EBC在某些情況下可能需要前額葉谷氨酸能神經(jīng)元參與的推測(cè)提供了目前為止最優(yōu)的方法。通過Pubmed的檢索,至今尚未發(fā)現(xiàn)以光刺激大腦內(nèi)某一類神經(jīng)元作為CS并成功建立EBC的報(bào)告。由此,我們采用光遺傳學(xué)技術(shù)特異操控內(nèi)側(cè)前額葉(medial prefrontal cortex, mPFC)的谷氨酸能神經(jīng)元,’并以光激活這一群谷氨酸能神經(jīng)元作為CS,從而探討此方式是否能成功建立delay-EBC及可能的內(nèi)在神經(jīng)機(jī)制。材料和方法：通過立體定向注射手段,把攜帶有細(xì)胞特異性啟動(dòng)子的視蛋白腺相關(guān)病毒AAV2/8-CaMKⅡα-ChR2-mCherry注射到mPFC。病毒注射3～4周后,一方面通過熒光顯微鏡及激光共聚焦顯微鏡來判斷神經(jīng)元膜表面是否表達(dá)有紅色熒光蛋白,以及其表達(dá)位置是否在mPFC,從而判斷光敏基因在谷氨酸能神經(jīng)元表達(dá)的特異性。并利用在體細(xì)胞外記錄技術(shù)觀察表達(dá)AAV2/8-CaMKⅡα-ChR2-mCherry的谷氨酸能神經(jīng)元對(duì)不同光刺激頻率的反應(yīng)特性,用以了解ChR2的通道生理功能,為行為學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。另一方面經(jīng)操控已經(jīng)表達(dá)在自由活動(dòng)動(dòng)物mPFC谷氨酸能神經(jīng)元上的ChR2通道完成行為學(xué)實(shí)驗(yàn)：待病毒AAV2/8-CaMKⅡα-ChR2-mCherry靶向注射到大鼠右側(cè)nPFC 4周后通過手術(shù)建立光神經(jīng)界面,并預(yù)留打藥孔,分別用藍(lán)光(470 nm,10 mW/mm2,30 ms波寬,20 Hz)激活mPFC谷氨酸能神經(jīng)元作為CS,電刺激眼輪匝肌作為US,觀察是否能建立delay-EBC;待條件行為建立完成后以微注射技術(shù)向mPFC光照射部位注射短時(shí)失活藥物muscimol (GABA-A受體激動(dòng)劑,氯離子通道開放導(dǎo)致氯離子大量進(jìn)入細(xì)胞而達(dá)到失活細(xì)胞的目的),觀察對(duì)delay-DEC的影響。結(jié)果：(1)病毒成功注射到mPFC,94.6 ±0.9%的CaMKIIa表達(dá)的谷氨酸能神經(jīng)元表達(dá)ChR2-mCherry蛋白,并且表達(dá)ChR2-mCherry蛋白的細(xì)胞98.87士0.3%是谷氨酸能神經(jīng)元,提示在CamKⅡ a啟動(dòng)子控制下,腺相關(guān)病毒載體可將光敏基因特異性的表達(dá)于谷氨酸能神經(jīng)元(2)表達(dá)有ChR2-mCherry蛋白的谷氨酸能神經(jīng)元對(duì)藍(lán)光(470 nm, 20 mW/mm2,5 ms波寬,5-80 Hz)產(chǎn)生穩(wěn)定的反應(yīng),對(duì)低頻光刺激(5、10和20Hz)的反應(yīng)性優(yōu)于高頻光刺激(40和80Hz)。(3)以藍(lán)光(470 nm,10 mW/mm2,30 ms波寬,20 Hz)激活mpfc谷氨酸能神經(jīng)元為CS的條件下,大鼠能成功建立眨眼條件反射行為,通過靶向微注射muscimol能明顯影響delay-EBC的條件反應(yīng)(conditioned response, CR)的表達(dá)。結(jié)論：通過一系列的努力探索終于成功構(gòu)建了眨眼條件反射的光遺傳學(xué)平臺(tái),我們發(fā)現(xiàn)特異性激活mPFC的一群谷氨酸能神經(jīng)元作為CS能成功建立delay-EBC,證明了我們之前推測(cè)的合理性。因此,本實(shí)驗(yàn)成功完成的意義不僅僅局限在技術(shù)平臺(tái)的建立,而是特別有利于推動(dòng)自由活動(dòng)動(dòng)物在體條件下對(duì)聯(lián)合性學(xué)習(xí)記憶的神經(jīng)細(xì)胞機(jī)制的進(jìn)一步研究。
【關(guān)鍵詞】：谷氨酸能神經(jīng)元 眨眼條件反射 光遺傳學(xué) 內(nèi)側(cè)前額葉
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R338
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)表5-6
• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-13
• 前言13-15
• 1 材料和方法15-26
• 2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果26-34
• 3 討論34-37
• 4 結(jié)論37-38
• 參考文獻(xiàn)38-41
• 文獻(xiàn)綜述41-49
• 參考文獻(xiàn)46-49
• 致謝49-50
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文50

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  本文關(guān)鍵詞：光遺傳學(xué)技術(shù)在眨眼條件反射研究中的初探，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：288425