發(fā)布時(shí)間：2017-04-06 12:02

  本文關(guān)鍵詞：豚鼠誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞樣細(xì)胞的建立，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)是指將體細(xì)胞進(jìn)行重編程,轉(zhuǎn)化為具有胚胎干細(xì)胞特性和功能的多能干細(xì)胞。誘導(dǎo)多能干細(xì)胞可以自我更新并可分化成各種類型的體細(xì)胞,不僅在替代療法上有重要價(jià)值,還可用于體外疾病模型的建立,以方便疾病機(jī)制的研究、藥物的監(jiān)測(cè)以及新治療方法的檢驗(yàn)。豚鼠(guinea pigs)由于具有某些特殊的生理解剖特點(diǎn)和生物學(xué)特性而被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域,故可以作為研究許多疾病致病機(jī)理與藥物篩選的理想動(dòng)物模型。但迄今為止,尚沒有有關(guān)豚鼠iPS細(xì)胞的研究報(bào)道。本研究以慢病毒為載體,以傳統(tǒng)的四因子誘導(dǎo)法(oct4、sox2、klf4和c-myc)對(duì)分離的胎兒豚鼠成纖維細(xì)胞進(jìn)行重編程,以獲得重編程的豚鼠iPS細(xì)胞系,為后續(xù)建立動(dòng)物疾病模型和藥物篩選模型奠定基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：1.通過組織塊貼壁法分別分離得到小鼠胚胎成纖維細(xì)胞和豚鼠胎兒成纖維細(xì)胞,兩種細(xì)胞均可穩(wěn)定傳代。豚鼠胎兒成纖維細(xì)胞在病毒感染和多次傳代后,細(xì)胞周期依舊正常,說明其可以作為重編程的靶細(xì)胞。2.使用四種不同轉(zhuǎn)染試劑：磷酸鈣法、脂質(zhì)體2000、脂質(zhì)體LTX和QuickShuttle-293試劑,通過三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,比較以上四種試劑對(duì)編碼綠色熒光蛋白(GFP)基因的重組慢病毒載體的包裝效率和對(duì)包裝細(xì)胞的毒性作用,以及包裝獲得的病毒感染豚鼠胎兒成纖維細(xì)胞的能力。通過流式細(xì)胞技術(shù)和MTT法分別檢測(cè)陽性細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞活性,最終顯示了QuickShuttle-293轉(zhuǎn)染試劑無論在慢病毒包裝過程中的轉(zhuǎn)染效率、細(xì)胞毒性及包裝后病毒的感染效率方面顯示出較好的效果。3.通過編碼傳統(tǒng)四因子(oct4、sox2、klf4和c-myc)基因的重組慢病毒感染豚鼠胎兒成纖維細(xì)胞,使之成功重編程為豚鼠iPS細(xì)胞,并比較了3種小分子物質(zhì)(維生素C、丙戊酸鈉、丁酸鈉)對(duì)細(xì)胞重編程的促進(jìn)作用,最終發(fā)現(xiàn)添加維生素C和丙戊酸鈉的培養(yǎng)基對(duì)重編程效率有著明顯提升。對(duì)所得到的豚鼠iPS樣克隆進(jìn)行了生物學(xué)特性檢測(cè)：1)對(duì)豚鼠iPS樣細(xì)胞進(jìn)行堿性磷酸酶染色,結(jié)果呈陽性；2)提取豚鼠iPS樣細(xì)胞RNA, RT-PCR檢測(cè)ES細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記基因,結(jié)果顯示其內(nèi)源性表達(dá)oct4, sox2, klf4, c-myc以及nanog基因；qPCR結(jié)果顯示,內(nèi)源性oct4、sox2、klf4、c-myc和nanog基因的表達(dá)遠(yuǎn)高于對(duì)照豚鼠成纖維細(xì)胞；3)提取豚鼠iPS樣細(xì)胞總蛋白,western blot結(jié)果顯示其高表達(dá)兩種ES細(xì)胞標(biāo)記蛋白：oct4和nanogo表明得到的豚鼠iPS細(xì)胞是具有多能性的。
【關(guān)鍵詞】：誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞 轉(zhuǎn)錄因子 慢病毒 豚鼠成纖維細(xì)胞 細(xì)胞重編程
【學(xué)位授予單位】：寧夏大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R329.2
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-7
• 英文縮略詞表7-9
• 第一章 文獻(xiàn)綜述9-19
• 1.1 體細(xì)胞重編程的機(jī)制和方法9-11
• 1.2 多能性干細(xì)胞的誘導(dǎo)方法和機(jī)制11-14
• 1.3 誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的研究現(xiàn)狀和應(yīng)用前景14-17
• 1.4 iPS細(xì)胞存在的問題17-18
• 1.5 本研究的目的和意義18-19
• 第二章 豚鼠胎兒成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)及生物學(xué)特性分析19-28
• 引言19
• 2.1 試驗(yàn)材料及試劑19-20
• 2.2 試驗(yàn)方法20-23
• 2.3 結(jié)果與分析23-26
• 2.4 討論26-27
• 2.5 小結(jié)27-28
• 第三章 不同轉(zhuǎn)染試劑對(duì)慢病毒包裝及包裝后病毒感染豚鼠成纖維細(xì)胞效率的影響28-38
• 引言28
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料28-29
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法29-32
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果32-36
• 3.4 討論36-37
• 3.5 小結(jié)37-38
• 第四章 豚鼠胎兒成纖維細(xì)胞來源的iPS細(xì)胞誘導(dǎo)及鑒定38-52
• 引言38
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料38-39
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法39-46
• 4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果46-50
• 4.4 討論50-51
• 4.5 小結(jié)51-52
• 結(jié)論52-53
• 參考文獻(xiàn)53-63
• 致謝63-64
• 個(gè)人簡介64

【引證文獻(xiàn)】

中國重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 劉璐璐;劉啟兵;許雪嬌;黃繼云;顏森泉;韓峰;樓宜嘉;;陽離子脂質(zhì)體Lipofectamine 2000介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞株的毒性作用[A];中國毒理學(xué)會(huì)第五次全國學(xué)術(shù)大會(huì)論文集[C];2009年

  本文關(guān)鍵詞：豚鼠誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞樣細(xì)胞的建立，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：288808