發(fā)布時間：2020-09-28 08:51

　　 第一部分體外calpain原位活化對大鼠腦組織stargazin/TARP-γ8的影響 目的：在中樞神經(jīng)系統(tǒng),AMPA受體介導(dǎo)快速興奮性突觸傳導(dǎo),突觸膜上AMPA受體的數(shù)量和功能直接影響突觸傳導(dǎo)的效能。TARPs作為跨膜AMPA受體調(diào)節(jié)蛋白家族,在AMPA受體由細(xì)胞內(nèi)向細(xì)胞外轉(zhuǎn)運、突觸膜定位及調(diào)節(jié)受體功能方面起著重要的作用。Calpain是一種鈣激活中性蛋白酶,活化后通過裂解AMPA受體亞單位來調(diào)節(jié)AMPA受體在突觸后致密區(qū)的表達(dá)。本部分實驗旨在通過原位活化calpain后,研究大鼠腦組織各部位跨膜AMPA受體調(diào)節(jié)蛋白家族(TARPs)的主要成員stargazin及TARP-γ8的表達(dá)情況,以明確calpain的活化是否會導(dǎo)致stargazin及TARP-γ8免疫活性的變化。 方法：實驗采用生后4周的SD雄性大鼠(n=4),斷頭取腦后直接制作冰凍切片(20μm),給予含有氯化鈣或者calpain抑制劑的緩沖液進(jìn)行預(yù)處理,采用免疫組織化學(xué)染色的方法,光鏡下觀察stargazin及TARP-γ8在各部分腦組織的表達(dá)情況。并且對不同預(yù)處理后的冰凍切片進(jìn)行western blot蛋白印跡法檢測,定量分析stargazin及TARP-γ8蛋白的表達(dá)情況。最后,為進(jìn)一步論證實驗結(jié)果,直接使用calpain活化腦細(xì)胞膜成分,使用western blot蛋白印跡法檢測stargazin及TARP-γ8的表達(dá)情況。 結(jié)果：冰凍切片的免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示,經(jīng)氯化鈣處理后,腦組織各區(qū)域包括小腦、海馬CA1、海馬CA3及大腦皮質(zhì)層中,stargazin的免疫反應(yīng)性明顯下降,P0.001。使用calpain抑制劑Ⅲ處理后,stargazin表達(dá)情況恢復(fù)到對照組水平,和氯化鈣組相比,結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義,p0.001。冰凍切片勻漿的western蛋白印跡結(jié)果顯示,氯化鈣處理后stargazin的蛋白表達(dá)量明顯降低,量化結(jié)果顯示,和對照組相比,stargazin下降的程度為80%左右,具有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義,p0.001。經(jīng)calpain抑制劑Ⅲ處理后,stargazin蛋白下降的效應(yīng)被阻斷,量化結(jié)果和對照組相仿,和氯化鈣處理組相比,結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義,p0.001。腦細(xì)胞膜成分的western蛋白印跡結(jié)果進(jìn)一步證實了免疫組化的結(jié)果,stargazin在經(jīng)活化的calpain處理后,表達(dá)明顯下降,和對照組相比,存在顯著差異,p0.001。和stargazin的結(jié)果不同,冰凍切片的免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示,氯化鈣處理后,TARP-γ8的免疫活性在海馬各區(qū)的椎體細(xì)胞胞體層明顯增加,樹突部位的免疫活性沒有發(fā)生變化,和對照組相比,胞體層蛋白表達(dá)水平的升高具有統(tǒng)計學(xué)差異,p0.001。給予calpain抑制劑Ⅲ處理后,并沒有改變TARP-γ8在海馬椎體細(xì)胞胞體層的免疫活性,表達(dá)情況和對照組相仿。在大鼠大腦皮層,不同處理組TARP-γ8的表達(dá)情況沒有發(fā)生變化。冰凍切片勻漿的western blot蛋白印跡結(jié)果顯示,各組TARP-y 8的表達(dá)沒有發(fā)生改變。腦組織膜成分的western blot蛋白印跡結(jié)果顯示,經(jīng)活化的calpain直接處理后,TARP-γ8的免疫表達(dá)沒有發(fā)生變化。 結(jié)論：本研究的結(jié)果表明1.stargazin作為calpain的作用底物,其羧基末端被原位活化的calpain所裂解。2.TARP-γ8并不是calpain的作用底物,但是它在海馬組織的表達(dá)和分布和鈣相關(guān),提示存在另一種鈣依賴的介導(dǎo)物質(zhì)。3. calpain介導(dǎo)的stargazin羧基末端裂解是一種通過calpain活化來調(diào)控突觸后致密區(qū)AMPA受體數(shù)目和功能的機(jī)制。 第二部分：Calpain活化介導(dǎo)的stargzain羧基端裂解在紅藻氨酸誘導(dǎo)驚厥中的作用 目的：作為興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸鹽的離子型受體,AMPA受體介導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮毒性反應(yīng)的病理生理過程。紅藻氨酸誘導(dǎo)的驚厥發(fā)作是研究癲癇和神經(jīng)興奮毒性損傷的經(jīng)典模型,同時紅藻氨酸也是體內(nèi)活化calpain的方法之一。本部分實驗主要研究紅藻氨酸誘導(dǎo)大鼠驚厥過程中,calpain體內(nèi)活化所介導(dǎo)的stargazin及TARP-γ8在大鼠腦組織各部分的表達(dá)變化情況,從而揭示calpain活化所介導(dǎo)的TARPs變化在驚厥及神經(jīng)元興奮毒性損傷中的作用及可能的潛在機(jī)制。 方法：實驗采用4周齡SD雄性大鼠(n=16),隨機(jī)分成紅藻氨酸誘導(dǎo)驚厥2小時組、紅藻氨酸誘導(dǎo)驚厥4小時組及相關(guān)對照組。驚厥組給予腹腔注射紅藻氨酸(10mg/Kg)。根據(jù)Racine分級判斷驚厥級別,驚厥發(fā)作達(dá)到第5階段或以上者納入實驗。驚厥組分別在驚厥發(fā)作2小時后及4小時后灌注取腦,通過免疫熒光檢測stargazin及TARP-γ8在大鼠腦組織各部位的分布及表達(dá)情況、stargazin及TARP-γ8和AMPA受體GluRl亞單位同時表達(dá)情況。另外,為進(jìn)一步證明免疫組織化學(xué)的結(jié)果,分別在驚厥發(fā)作2小時和4小時后獲取大鼠小腦、海馬和大腦皮層部位的組織,通過western blot蛋白印跡法定量檢測stargazin在腦組織不同部位的表達(dá)情況。 結(jié)果：免疫熒光的結(jié)果顯示,紅藻氨酸誘導(dǎo)驚厥發(fā)作后2小時以及4小時,在小腦浦肯野纖維細(xì)胞、海馬CA1、CA3、齒狀回以及大腦的梨狀皮層中,stargazin的表達(dá)明顯下降。量化結(jié)果顯示,和對照組相比,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義,p0.01。驚厥不同時間組之間比較,stargazin的表達(dá)沒有發(fā)生變化。另外,在海馬及大腦皮層,stargazin和AMPA受體的GluRl亞單位同時表達(dá),在紅藻氨酸誘導(dǎo)驚厥后,腦組織各部位的GluRl表達(dá)水平明顯下降,下降程度和stargazin相仿,和對照組相比,差異存在統(tǒng)計學(xué)意義,p0.01。Western blot蛋白印跡檢測的結(jié)果和免疫熒光結(jié)果一致。和體外實驗不同的是,紅藻氨酸誘導(dǎo)驚厥后,TARP-γ8在海馬部位的表達(dá)水平降低,和對照組相比存在統(tǒng)計學(xué)差異,p0.01。TARP-γ8在大鼠大腦皮層的表達(dá)水平?jīng)]有發(fā)生變化,和體外結(jié)果一致。 結(jié)論：1.體內(nèi)紅藻氨酸誘導(dǎo)的calpain活化導(dǎo)致stargazin羧基末端裂解。2.雖然TARP-γ8不是calpain的作用底物,但是在驚厥過程中TARP-γ8在海馬的表達(dá)和分布呈現(xiàn)一個鈣依賴的過程,提示可能存在另一種鈣依賴物質(zhì)介導(dǎo)TARP-γ8的降解。3.在驚厥發(fā)生過程中,calpain活化介導(dǎo)的stargazin降解可能是一種減少神經(jīng)興奮毒性損傷的反饋性保護(hù)機(jī)制。4. calpain介導(dǎo)的stargazin羧基末端裂解可能是一種通過calpain活化來調(diào)節(jié)AMPA受體藥理學(xué)性質(zhì)的機(jī)制,為癲癇治療學(xué)提供新的研究方向。
【學(xué)位單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2011
【中圖分類】：R346
【文章目錄】：
中文摘要
英文摘要
前言
    參考文獻(xiàn)
第一部分:體外calpain原位活化對大鼠腦組織stargazin/TARP-γ8的影響
    材料與方法
    結(jié)果
    討論
    結(jié)論
    參考文獻(xiàn)
第二部分:Calpain活化介導(dǎo)stargazin羧基端裂解及其在紅藻氨酸誘導(dǎo)驚厥中的作用
    材料與方法
    結(jié)果
    討論
    結(jié)論
    參考文獻(xiàn)
綜述:AMPA受體跨膜調(diào)節(jié)蛋白的研究進(jìn)展
    參考文獻(xiàn)
發(fā)表論文1
發(fā)表論文2
致謝

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：2828583