豬是人類最早馴化的動物之一,中國人馴養(yǎng)家豬的歷史可以追溯到新石器時代。而近年來,與豬相關的研究課題一直是研究熱點。一方面,豬是畜牧經(jīng)濟的重要物種,豬的抗病研究與人民的生產(chǎn)生活息息相關；另一方面,豬的生理構(gòu)造與人類更接近,以豬作為模擬人類疾病模型的模式動物能幫助科學家攻克諸多疾病。豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)又稱藍耳病病毒,具有超強傳染性。高致病性藍耳病會導致母豬繁殖功能障礙和仔豬死亡,對養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失�？茖W家們采用各種手段致力于攻克藍耳病,但尚未取得決定性的進展。本研究中,我們試圖通過轉(zhuǎn)基因的方法培育自身能夠抗藍耳病的新品系豬種。過去研究發(fā)現(xiàn),HDAC6是一種特殊的組蛋白去乙酰化酶,除了調(diào)控組蛋白的乙�；酵�,其對胞質(zhì)中微管蛋白的乙酰化水平同樣具有調(diào)節(jié)作用。HDAC6蛋白定位在細胞質(zhì)中,對細胞遷移、免疫突觸形成、病毒入侵時對細胞的調(diào)節(jié)具有重要作用。因此,我們推測過表達HDAC6基因會增強動物對病毒入侵的抵抗作用。在本研究中,我們通過轉(zhuǎn)基因克隆的手段,制備了過表達HDAC6轉(zhuǎn)基因的豬,并通過體外細胞攻毒試驗和體內(nèi)攻毒試驗證明了其抗病功能。首先我們構(gòu)建了表達豬jHDAC'6基因的載體,通過細胞轉(zhuǎn)染的方式將載體轉(zhuǎn)染到豬胎兒成纖維細胞內(nèi)。通過單克隆細胞篩選以及體細胞核移植的手段,得到25頭F0代的過表達HDAC6轉(zhuǎn)基因克隆母豬。我們選擇Fo代的部分陽性克隆母豬傳代配種,得到80頭F1代HDAC6轉(zhuǎn)基因豬。接下來通過分子檢測確定了陽性率和表達量,證明了HDAC6基因過表達,實現(xiàn)了種系傳遞。我們選取PRRSA/攻毒中常用的PRRSV CH1a毒株,利用F1代豬制備的轉(zhuǎn)基因陽性豬和陰性豬的肺泡巨噬細胞(PAMs),設計了24 hpi,48hpi,72 hpi三個時間點進行攻毒實驗,發(fā)現(xiàn)攻毒后轉(zhuǎn)基因陽性PAMs組的帶毒量顯著低于陰性PAMs組,證明了細胞水平上過表達HDAC6對PRRSV的抵抗作用。根據(jù)細胞實驗的結(jié)果,我們選擇4-6周的F1代仔豬共42頭進行活體PRRSV攻毒試驗和同居感染實驗。毒株選取了在我國流行的高致病性毒株PRRSV NVDC JXAl,攻毒劑量為100 TCIDso。通過嚴格的個體攻毒和同居實驗,我們證明了HDACt過表達轉(zhuǎn)基因豬在藍耳病病毒入侵時,能夠阻礙病毒復制,延緩發(fā)病時間,減弱發(fā)病癥狀。實驗證明過表達HDAC6轉(zhuǎn)基因豬在體外攻毒實驗和體內(nèi)攻毒實驗中均表現(xiàn)出對藍耳病病毒的抗性。過去研究表明,Leptin基因(obese基因,ob)在血糖和脂肪代謝通路中起到重要調(diào)控作用。Leptin通過影響下丘腦的激素分泌,從而對食物攝入,能量消耗以及糖代謝和脂代謝起到調(diào)控作用。obese基因自然突變小鼠(ob/ob、鼠)模型由于其肥胖及相關并發(fā)癥被廣泛用于醫(yī)學實驗及藥物篩選。然而Leptin突變小鼠模型在糖尿病藥物臨床試驗中,未能反映治療藥物誘發(fā)心臟病的副作用。所以我們需要與人類生理結(jié)構(gòu)更為接近的模式動物。小型豬與人類的脂肪積累方式和藥物敏感度更接近。因此為了建立更適合人類肥胖癥的疾病模型,本研究以小型豬為模式動物進行Leptin基因敲除。我們利用基因定點修飾的新技術(shù)鋅指核酸酶敲除技術(shù)實現(xiàn)了Leptin基因定點突變,篩選到了11個陽性突變克隆,突變率達到了8.3%。通過體細胞移植,共獲得克隆豬18頭,存活11頭,經(jīng)過PCR測序驗證,2頭為雙敲個體,有7頭單敲個體,2頭陰性個體。并且通過傳代配種,獲得了72頭F1代Leptin基因敲除豬,其中包括35頭單敲個體,37頭陰性個體。通過該方法可在一年時間內(nèi)獲得含有兩個等位基因同時發(fā)生敲除的克隆豬,極大的縮短了實驗周期。Leptin雙敲豬相比野生型豬表現(xiàn)出體型肥胖、高體脂含量、高血糖、高血脂、胰島素抵抗等特性,符合肥胖疾病模型應有的病理特征。接下來我們將利用此疾病模型,展開更多的病理學和生理學研究。綜上所述,我們通過轉(zhuǎn)基因的方法建立了HDAC6過表達轉(zhuǎn)基因豬,證明過表達豬的HDAC6基因?qū)τ谒{耳病病毒的入侵和復制有抵抗作用,為預防和治療藍耳病提供了新的思路和途徑。同時我們還首次利用鋅指核酸酶技術(shù)構(gòu)建了Leptin敲除的肥胖疾病模型豬,為研究人類肥胖引發(fā)的相關疾病提供了新的途徑。
【學位單位】：中國農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2014
【中圖分類】：S858.28;R589.2;R-332
【部分圖文】：

此后，ＰＲＲＳＶ在中國廣泛流行，并產(chǎn)生了各種突變的毒株（Ｃｈｅｎｅｔａｌ．，２００６；ＧａｏｅｔａＵ逡逑２００４）。自２００６年６月Ｗ來，我國爆發(fā)了一種導致豬出現(xiàn)高熱、皮膚發(fā)巧、離發(fā)滿率和高死ｔ率逡逑的流行病，在多省市流行（圖１－２）。巧致病性Xi耳病的捕狀主耍巧現(xiàn)為楠豬持續(xù)商熱，Ｗ超過４１邋Ｃ逡逑Ｈ天Ｗ上，咳嗽氣喘，結(jié)膜炎，部分豬后軀無力，共濟失調(diào)等癥狀，仔豬的發(fā)病率高達１００％，逡逑巧豬流產(chǎn)率也商達３０％ｙ＞上，而成年巧肥豬也可能發(fā)病致死（農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)局．２００７）。根據(jù)Ｗ＿ｈ特征，逡逑我閩科學家由此分離到了新的ＰＲＲＳＶ鴻株，即高致巧性豬繁殖叫巧吸綜合征病靖－ＨＰ邋ＰＲＲＳＶ。逡逑ＨＰ邋ＰＲＲＳＶ是北美亞型的一種新的突變毒株，在化ｐ２蛋白上發(fā)生了氨基酸殘基的缺失突變巧ａｎ邋ｅｔ逡逑ａｌ．．邋２００７）。這次高致病性盛耳病的爆發(fā)對我園的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨NB的打擊，經(jīng)濟損失高達１００億逡逑元人民幣。自此，高致病性ＰＲＲＳＶ的研究和防治就成為

眼部出現(xiàn)結(jié)膜炎，眼隱水腫、分泌物多；咳嗽、氣喘等呼吸道癥狀。部分病豬還會出現(xiàn)四肢乏力、逡逑顫抖，或不能站立、共濟失調(diào)等神經(jīng)癥狀。ＰＲＲＳＶ可通過血液循環(huán)穿過胎盤使胎豬受到感染，逡逑從而導致巧娠母豬出現(xiàn)流產(chǎn)，產(chǎn)木乃伊胎和死胎（圖１－３）。高致病性ＰＲＲＳＶ具有較強的傳染力，逡逑較長的流行期，在一個地區(qū)內(nèi)傳播數(shù)月無明顯好轉(zhuǎn)，常規(guī)治巧不能產(chǎn)生顯著效果（Ｔｉａｎ邋ｅｔ邋ａｌ．，２００７）。逡逑ＰＲＲＳＶ主要通過豬之間的身體接觸、粘液接觸和空氣傳播等方式傳染。其中身體接觸包括逡逑共同飼養(yǎng)的豬互相觸碰，Ｗ及其分泌物和排泄物之間的互相沾染。粘液接觸范圍包括豬的唾液、逡逑精液、乳汁、糞便、血液等帶有病毒的分泌物。還有間接接觸也可能導致Ｐ民民ＳＶ傳播，比如豬逡逑場工作人員的服裝、手套、鞋、帽和飼養(yǎng)籠、床等接觸過發(fā)病豬的物品�？諝鈧鞑ナ侵冈谝欢l逡逑件的風速、風向、濕度、溫度下，ＰＲＲＳＶ可Ｗ通過空氣傳播到周圍地區(qū)，造成大面積影響（Ｄｅｓｒｏｓｉｅｒｓ逡逑ｅｔａｌ．．邋２０１１）。因此一旦某豬場化現(xiàn)ＰＲＲＳＶ感染，同地區(qū)的周邊豬場很容易受到傳染。除此之外，逡逑豬場容易滋生的蚊陋蟲等也可能作為ＰＲＲＳＶ傳播的載體，病毒在家蛹體內(nèi)甚至能保持活性超過逡逑１２邋ｈ。而鳥類、禽類也可能攜帶ＰＲＲＳＶ進行更遠距離的傳播（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ邋ｅｔ邋ａｈ，邋１９９７）。逡逑ＰＲＲＳＶ對養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大危害

瑚逡逑、廣、＾＇＇邋？產(chǎn)＾邋＾逡逑六’逡逑圖１－２邋２００６年在中國多地爆發(fā)大規(guī)模藍耳病事件的地點示意圖（Ｔｉａｎ邋ｅｔ邋ａｌ．．邋２００７）。逡逑巧ｇ．邋１－２邋Ｏｕｔｂｒｅａｋ邋ｓｉｔｅｓ邋ｏｆ邋化ｅ邋２００６邋ＰＲＲＳ邋ｅｐｉｄｅｍｉｃ邋ｉｎ邋Ｃｉｉｉｎａ（Ｔｉａｎ邋ｅｌ邋ａｌ＂邋２００７）．逡逑高致病性豬v愣〔≈沓絲桑蹋�；ｉ臭湀�(zhí)忱抖≈⒆賜猓拱橛刑邐旅饗隕擼錚矗潁悴⒊皺義閑程歟咨希黃し舴⒑歟糠種磯�、鼻尖、唆[�、尾部出血、疲血呈孜r焐�；食欲减退或废绝Ｕd義涎鄄砍魷紙崮ぱ�，眼隐水肿、分弥X鋃啵豢人�、气喘等呼吸禈发椎A２糠植≈砘夠岢魷炙鬧αΑ㈠義喜�，幌娀能站立、共济失淀d壬窬⒆礎＃校遙遙櫻摯賞ü貉反┕ヅ淌固ブ硎艿礁腥荊義洗傭賈慮繕錟鋼沓魷至韃�，产木乃伊胎和藫匹（哇E保常８咧虜⌒裕校遙遙櫻志哂薪锨康拇玖�，辶x轄銑さ牧饜釁�，哉浕庚_厙詿ナ攣廾饗院米�，常箣呶莿x荒懿災Чǎ裕椋幔鑠澹澹翦澹幔歟�，２００ＡPｅ義希校遙遙櫻種饕ü碇淶納硤褰喲�、镇G航喲ズ涂掌サ確絞醬盡Ｆ渲猩硤褰喲グㄥ義瞎餐茄鬧砘ハ啻ヅ觶準捌浞置諼錆團判刮鎦淶幕ハ嗾慈盡Ｕ騁航喲シ段Оㄖ淼耐僖骸㈠義暇�、葯┉、粪便、血液祬s脅《鏡姆置諼鎩；褂屑浣詠喲ヒ部贍艿賈攏忻衩瘢櫻執(zhí)

本文編號：2828633