【摘要】：第一部分體外誘導人臍帶間充質干細胞向Ⅱ型肺泡上皮細胞分化目的:本研究旨在通過條件培養(yǎng)基誘導人臍帶間充質干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,h UC-MSCs)向Ⅱ型肺泡上皮細胞(typeⅡalveolar epithelial cells,AEC2s)分化,為后續(xù)研究h UC-MSCs來源的AEC2s在肺部疾病中的治療作用奠定基礎。方法:h UC-MSCs分為實驗組和對照組,實驗組用小氣道上皮細胞生長基礎培養(yǎng)基培養(yǎng)2天后添加生長因子誘導培養(yǎng);對照組用20%血清的DMEM/F12培養(yǎng)。第14天觀察細胞形態(tài);Western blot、免疫熒光、流式細胞術和ELISA法檢測肺泡表面活性蛋白C(surfactant protein C,SP-C)及前肺泡表面活性蛋白C(pro-surfactant protein C,pro SP-C);透射電鏡觀察板層小體。結果:實驗組細胞形態(tài)由長梭形向多邊形轉變,細胞內有pro SP-C明顯表達,培養(yǎng)基上清中有SP-C分泌,透射電鏡觀察到板層小體;而對照組細胞形態(tài)無明顯改變,未檢測到pro SP-C表達、SP-C分泌和板層小體形成。結論:本研究結果表明體外誘導培養(yǎng)可促進h UC-MSCs向AEC2s分化,通過該方法有望大量獲得h UC-MSCs來源的AEC2s用于肺部疾病治療研究。第二部分誘導來源Ⅱ型肺泡上皮細胞對肺纖維化模型小鼠的治療作用及機制初探目的:建立博來霉素(Bleomycin,BLM)引起的肺纖維化小鼠(pulmonary fibrosis,PF)模型,觀察誘導來源Ⅱ型肺泡上皮細胞(h UC-MSCs-derived AEC2s)對肺纖維化模型小鼠的治療作用,討論其中可能的機制。方法:將C57BL/6小鼠分為空白對照組、安全性對照組、肺纖維化模型組、治療組,每組8只小鼠。10%水合氯醛(3ml/kg)麻醉后行氣管插管。肺纖維化模型組及治療組滴入博來霉素3 mg/kg,向空白對照組和安全性對照組滴入生理鹽水50μl。造模后第7 d,使用相同方法麻醉并氣管插管后,治療組及安全性對照組滴入h UC-MSCs-derived AEC2s細胞懸液,空白對照組及肺纖維化模型組滴入生理鹽水40μl。第21 d處死小鼠并采集標本。統(tǒng)計生存率,觀察肺組織病理改變,分析肺組織膠原含量的變化及相關纖維化蛋白的表達,免疫組化檢測pro SP-C表達。將h UC-MSCs-derived AEC2s和A549細胞進行共培養(yǎng),探討h UC-MSCs-derived AEC2s對A549增殖的影響。結果:經(jīng)氣管插管給予博來霉素的肺纖維化模型組,與空白對照組比較,H.E染色顯示肺泡間隔增厚,Masson染色顯示纖維條索增加,并且肺內膠原含量上升,肺內α-sma和vimentin等纖維標志物表達增強,表明博來霉素小鼠模型構建成功。h UC-MSCs-derived AEC2s治療肺纖維化模型小鼠,提高了其生存率,肺組織病理學顯示肺間隔增厚程度得到改善,肺內炎性細胞聚集減少,膠原含量明顯降低,α-sma和vimentin表達下降,肺內pro SP-C表達增加。體外實驗發(fā)現(xiàn)h UC-MSCs-derived AEC2s可以促進A549增殖。結論:h UC-MSCs-derived AEC2s可以改善博來霉素所致小鼠肺纖維化程度,有可能是通過促進AEC2s增殖所起的作用。
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R725.6;R-332
【圖文】：

樣品脫水和包埋。超薄切片后在日立 H-7500 透射電鏡下觀察拍照。.2.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計運用 SPSS 11.5 軟件進行顯著性差異分析，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（X示，兩組之間均數(shù)比較采用 t 檢驗，當 p＜0.05 時認為差異有統(tǒng)計學意義。2 結果.1 細胞形態(tài)在 DMEM/F12 培養(yǎng)基中培養(yǎng)至第 4 代的 hUC-MSCs 在光鏡下呈長梭形，不一向外伸出的突起并且在細胞生長過程中可以觀察到螺旋狀匯合。在小皮細胞生長基礎培養(yǎng)基培養(yǎng) 2 d 后，細胞間連接改變。在條件培養(yǎng)基培養(yǎng)4 d 可明顯觀察到細胞骨架，細胞形態(tài)由長梭形轉變?yōu)楸馄綘睿瑢⒓毎伆�，在貼壁后可觀察到細胞呈不規(guī)則多邊形并有立體感。0 d 2 d

重慶醫(yī)科大學碩士研究生學位論文MSCs 誘導前后細胞干性檢測表面間充質干細胞標志物檢測EM/F12 培養(yǎng)基中培養(yǎng)的 hUC-MSCs 表面分子 CD34、CD45 2%，CD73、CD90、CD105 陽性率高于 95%，符合 2006 年發(fā)布的標準[10]。誘導來源的 AEC2s 表面 CD34、CD45、HL2%, CD73 和 CD105 陽性率明顯降低，低于 80%, CD90 陽性95%。

26圖 1-3 誘導來源的 AEC2s 表面間充質干細胞標志物Figure1-3 hUC-MSCs-derived AEC2s CD marker分化EM/F12 培養(yǎng)基中培養(yǎng)的 hUC-MSCs 通過誘導可以分化細胞。而誘導來源的 AEC2s 不能在成骨、成脂或成軟骨

【參考文獻】

相關期刊論文 前4條

1 高黎;祝華;張榮;王莉佳;鄒琳;符州;;BrdU標記人臍帶間充質干細胞及對細胞生物學行為影響的體外研究[J];重慶醫(yī)科大學學報;2014年11期

2 中華醫(yī)學會兒科學分會呼吸學組全國兒童彌漫性肺實質疾病/肺間質疾病協(xié)作組;趙順英;農(nóng)光民;;兒童肺間質疾病診斷程序專家共識[J];中華兒科雜志;2013年02期

3 陳寅;馬南;梅舉;肖海波;陸善偉;徐懷陽;鐘z

本文編號：2787058