【摘要】：背景:在胸腺中,T細(xì)胞的增殖和分化需經(jīng)過一系列具有特異性表達(dá)和調(diào)節(jié)的基因的多重檢查點(diǎn)的嚴(yán)格調(diào)控。胸腺細(xì)胞分為以下幾個(gè)階段:DN(CD4~-CD8~-Double-negative,雙陰性)階段,DP(CD4~+CD8~+Double-positive,雙陽性)階段和CD4 SP(CD4~+CD8~-single-positive,CD4單陽性)和CD8 SP(CD4~-CD8~+single-positive,CD8單陽性)階段。其DN階段又根據(jù)復(fù)雜的調(diào)控,并且最終以CD44和CD25為細(xì)胞表面標(biāo)志進(jìn)行具體的劃分,包括DN1(CD25~-CD44~+),DN2(CD25~+CD44~+),DN3(CD25~+CD44~-)和DN4(CD25~-CD44~-)階段。TCR(T cell receptor,T細(xì)胞受體)能夠誘導(dǎo)胸腺細(xì)胞存活、增殖和分化的不依賴配體的激活信號(hào)的活化。TCR在胸腺細(xì)胞的分化發(fā)育過程中同樣也發(fā)揮了重要的作用。TCR是富含核心巖藻糖基化的糖蛋白。Fut8(core fucosyltransferase,核心巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶)介導(dǎo)的核心巖藻糖基化是一種重要的翻譯后修飾過程,并且已顯示了其修飾對(duì)于細(xì)胞表面上各種糖蛋白分子的功能和穩(wěn)定性是必需的。Fut8通過核心巖藻糖基修飾能改變底物蛋白的構(gòu)象、表達(dá)及定位,在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)揮了重要作用。目的:利用Fut8基因敲除(Fut8~(-/-))小鼠與正常(Fut8~(+/+))小鼠,探究Fut8在小鼠胸腺中T細(xì)胞的分化發(fā)育的調(diào)節(jié)作用,主要探究TCR的核心巖藻糖基化對(duì)于胸腺DP階段發(fā)育的重要性。方法:將4~8周齡的Fut8~(+/+)小鼠的胸腺細(xì)胞進(jìn)行分選,利用FACS(Fluorescence Activated Cell Sorter,流式細(xì)胞儀)檢測(cè)不同發(fā)育階段的細(xì)胞表面的核心巖藻糖基化。利用同窩出生的Fut8~(+/+)和Fut8~(-/-)小鼠為對(duì)象,通過流式細(xì)胞儀分選出各個(gè)階段DN1、DN2、DN3、DN4、DP CD4 SP及CD8 SP的細(xì)胞,然后進(jìn)行計(jì)數(shù),并探究核心巖藻糖基化的缺失對(duì)小鼠胸腺細(xì)胞發(fā)育不同階段的細(xì)胞數(shù)目的影響。利用IP(Immunoprecipitation,蛋白免疫沉淀),Western Blot(蛋白質(zhì)免疫印跡)和FACS檢測(cè)DP細(xì)胞TCR及TCR上核心巖藻糖基化的差異。在利用Western Blot檢測(cè)DP細(xì)胞磷酸化的水平后,為了進(jìn)一步探究TCR核心巖藻糖基化在DP階段的作用,我們利用特異性切割核心巖藻糖糖苷鍵(β1-6)的糖苷酶處理TCR特異性轉(zhuǎn)基因OT-I和OT-II小鼠的DP細(xì)胞,再利用Western Blot檢測(cè)TCR的核心巖藻糖基化的改變對(duì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響,同時(shí)也利用MTT和細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力。最后利用Q-PCR(Real-time Quantitative PCR Detecting System,熒光實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))檢測(cè)與胸腺發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子的變化。結(jié)果:通過流式結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)核心巖藻糖基化在胸腺細(xì)胞不同發(fā)育階段的表達(dá)是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化的過程,其在胸腺細(xì)胞在由DN階段向DP階段轉(zhuǎn)變過程中顯著增多。核心巖藻糖基化的缺失導(dǎo)致胸腺中DP細(xì)胞數(shù)目明顯減少。對(duì)DP胸腺細(xì)胞的研究結(jié)果表明,與Fut8~(+/+)DP細(xì)胞相比,Fut8~(-/-)DP細(xì)胞的增殖能力及磷酸化水平明顯減弱。并且我們發(fā)現(xiàn),TCR上核心巖藻糖基化的缺失,會(huì)使TCR的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)能力下降,并且細(xì)胞增殖也減弱。Q-PCR結(jié)果顯示,Fut8~(-/-)DP細(xì)胞中與胸腺細(xì)胞分化密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子Id2及E2a的表達(dá)異常。結(jié)論:在小鼠胸腺中,核心巖藻糖基化修飾在T細(xì)胞的正常分化中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用,并且發(fā)現(xiàn)TCR的核心巖藻糖基化對(duì)調(diào)節(jié)DP階段的胸腺發(fā)育至關(guān)重要。
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R392
【圖文】：

結(jié)果1. 核心巖藻糖基化在整個(gè)胸腺細(xì)胞分化過程中的動(dòng)態(tài)變化糖基化能夠影響 T 細(xì)胞的發(fā)育，生存和相關(guān)的代謝反應(yīng)[6-11]。為了檢測(cè)核藻糖基化在胸腺發(fā)育中可能存在的調(diào)節(jié)作用，我們利用能夠特應(yīng)性識(shí)別核心巖糖基化結(jié)構(gòu)的 LCA 對(duì)分選出的 Fut8+/+小鼠的不同發(fā)育階段的胸腺細(xì)胞進(jìn)行染利用細(xì)胞表面標(biāo)記物，CD4 和 CD8 進(jìn)行細(xì)胞染色后，分選 DN、DP、CD4 SP、SP 細(xì)胞，然后將 DN、DP、CD4 SP、CD8 SP 細(xì)胞分別進(jìn)行 LCA 染色。利用 Fl進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ut8+/+小鼠 DP 比 DN 胸腺細(xì)胞的核心巖藻糖基化水平顯著（**P<0.01）（圖 1.1A）。同時(shí)在胸腺細(xì)胞發(fā)育 CD4 SP、CD8 SP 階段，核心巖基化水平仍然保持著較高的水平（圖 1.1B）。

大連醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文binding on thymic subpopulations (n=6). (**p＜0.01)2. Fut8-/-胸腺細(xì)胞表面的核心巖藻糖基化消失我們將對(duì) Fut8+/+和 Fut8-/-胸腺細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞分析，比較 Fut8+/+和 Fut8-/-胸腺細(xì)胞各發(fā)育階段的 LCA 染色情況。Fut8-/-胸腺細(xì)胞在 DN、DP、CD4 SP 及 CD8 SP階段的 LCA 染色為陰性（圖 1.2）。雖然 Fut8+/+DN、DP、CD4 SP 及 CD8 SP 階段表達(dá)情況不同，但各階段細(xì)胞均顯示 LCA 染色陽性。

結(jié)果1. Fut8-/-小鼠顯示胸腺發(fā)育異常為了探索在小鼠體內(nèi) Fut8 與胸腺發(fā)育的關(guān)系，我們將同窩出生四周的 Fut8+/和 Fut8-/-小鼠的全胸腺進(jìn)行對(duì)比，如圖 2.1A 所示，F(xiàn)ut8-/-小鼠胸腺較 Fut8+/+小鼠的胸腺明顯偏小。通過 HE 免疫組化染色分析，F(xiàn)ut8-/-小鼠的髓質(zhì)明顯減少(圖 2.1B)因?yàn)樗栀|(zhì)中分布有較成熟的胸腺細(xì)胞，因此推測(cè) Fut8-/-小鼠較成熟胸腺細(xì)胞的數(shù)量會(huì)受到影響。LCA 的染色結(jié)果顯示，F(xiàn)ut8+/+小鼠的整個(gè)胸腺中核心巖藻糖基高表達(dá)而 Fut8-/-小鼠中則幾乎沒有表達(dá)(圖 2.1B）。通過胸腺細(xì)胞全蛋白的 AAL[24]和 LC染色，我們發(fā)現(xiàn)在 Fut8-/-鼠中核心巖藻糖基化消失(圖 2.1C)。說明 Fut8 的缺失與胸腺分化發(fā)育密切相關(guān)。

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本文編號(hào)：2786731