本文關(guān)鍵詞：旋毛蟲(chóng)谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的克隆表達(dá)及鑒定，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(Glutathione-S-transferase,GST)是一種具有解毒功能的酶,對(duì)各種有害的外源性化合物(如致癌物質(zhì)和誘變劑)與細(xì)胞內(nèi)源性化合物(如脂質(zhì)過(guò)氧化合物)均有分解功能。GST在寄生蟲(chóng)的抗氧化系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用,它可以除去大部分的外源性和內(nèi)源性的親電子化合物,有助于寄生蟲(chóng)在宿主內(nèi)的生存。GST蛋白酶在一些寄生蟲(chóng)中已被鑒定并有所研究,如犬惡絲蟲(chóng)、馬來(lái)絲蟲(chóng)、日本血吸蟲(chóng)、曼氏血吸蟲(chóng)、肝片吸蟲(chóng)及豬帶絳蟲(chóng)等,但關(guān)于旋毛蟲(chóng)GST的研究目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究利用生物信息學(xué)分析了Ts GST與其它寄生蟲(chóng)及模式生物GST的進(jìn)化關(guān)系,應(yīng)用分子克隆基因技術(shù)表達(dá)并純化了一種旋毛蟲(chóng)谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶Ts GST,獲得r Ts GST蛋白及其免疫血清。通過(guò)SDS-PAGE和Western blot分析了該重組蛋白的抗原性及免疫原性,RT-PCR、Western blot及免疫熒光試驗(yàn)(IFA)鑒定了Ts GST基因在旋毛蟲(chóng)不同發(fā)育蟲(chóng)期的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)及其在蟲(chóng)體的定位;觀察了r Ts GST免疫小鼠后的抗體應(yīng)答類型及對(duì)宿主的免疫保護(hù)作用、免疫血清對(duì)旋毛蟲(chóng)侵入腸上皮細(xì)胞(IEC)的影響及免疫血清介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞對(duì)旋毛蟲(chóng)的殺傷作用(ADCC)。運(yùn)用生物化學(xué)方法分析了r Ts GST的酶活性及其最佳反應(yīng)條件。本研究鑒定了r Ts GST的性質(zhì)及其功能,為闡明旋毛蟲(chóng)的侵入、生存及其與宿主小腸上皮細(xì)胞的相互作用和致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。材料與方法1.旋毛蟲(chóng)蟲(chóng)種、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞系旋毛蟲(chóng)(Trichinella spiralis)由鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院寄生蟲(chóng)教研室昆明小鼠傳代保種。BALB/c小鼠、4-6周齡,購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。所用細(xì)胞系為小鼠腸上皮細(xì)胞(intestinal epithelial cells,IEC),是由本教研室分離培養(yǎng)。2.r Ts GST的免疫學(xué)分析將r Ts GST免疫BALB/c小鼠,獲得r Ts GST免疫血清,應(yīng)用旋毛蟲(chóng)感染小鼠血清及r Ts GST通過(guò)ELISA及Western blot鑒定r Ts GST的抗原性。3.Ts GST基因的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)及定位收集旋毛蟲(chóng)的感染性幼蟲(chóng)、成蟲(chóng)、新生幼蟲(chóng)及肌幼蟲(chóng),提取總RNA進(jìn)行RT-PCR,擴(kuò)增Ts GST基因及內(nèi)參基因GAPDH,檢測(cè)Ts GST基因的表達(dá)時(shí)相。收集小鼠感染旋毛蟲(chóng)后3d與7d的成蟲(chóng),新生幼蟲(chóng)及肌幼蟲(chóng),制備可溶性抗原進(jìn)行Western blot,用r Ts GST免疫血清對(duì)不同蟲(chóng)期的可溶性抗原進(jìn)行識(shí)別,檢測(cè)Ts GST蛋白在不同蟲(chóng)期是否有表達(dá)。收集旋毛蟲(chóng)感染性幼蟲(chóng)、3d與7d成蟲(chóng)、新生幼蟲(chóng)及肌幼蟲(chóng),IFA檢測(cè)r Ts GST免疫血清與旋毛蟲(chóng)不同發(fā)育時(shí)期蟲(chóng)體的反應(yīng)性,觀察Ts GST蛋白在蟲(chóng)體的定位。將收集的不同期蟲(chóng)體進(jìn)行石蠟包埋組織切片,通過(guò)IFA觀察Ts GST蛋白在不同時(shí)期蟲(chóng)體的具體定位。4.r Ts GST蛋白的免疫保護(hù)性分析將60只BALB/c小鼠隨機(jī)分為3組(每組20只):分別為r Ts GST蛋白免疫組、佐劑及PBS對(duì)照組。按20μg蛋白/只小鼠的劑量進(jìn)行皮下多點(diǎn)注射,每隔10 d免疫1次,共3次,末次免疫后10 d,每只小鼠經(jīng)口攻擊感染300條旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)。攻擊感染后7d每組各剖殺10只小鼠,回收腸道期成蟲(chóng)并計(jì)算成蟲(chóng)減蟲(chóng)率,剩余小鼠感染后42 d剖殺,收集肌幼蟲(chóng)并計(jì)算肌幼蟲(chóng)減蟲(chóng)率。同時(shí)收集小鼠免疫后不同時(shí)間血清,利用ELISA分析r Ts GST蛋白免疫小鼠所引起的免疫反應(yīng)類型。5.r Ts GST免疫血清對(duì)旋毛蟲(chóng)侵入IEC的影響及ADCC作用為了觀察r Ts GST免疫血清體外對(duì)旋毛蟲(chóng)侵入IEC的影響,將r Ts GST免疫血清、感染后42 d小鼠血清及正常小鼠血清分別與半固體培養(yǎng)基按1:10混合,加入感染性幼蟲(chóng),覆蓋到IEC細(xì)胞表面,37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)2 h,觀察幼蟲(chóng)侵入IEC細(xì)胞的情況,計(jì)算侵入率。將旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)與小鼠腹腔巨噬細(xì)胞共同培養(yǎng),并加入不同濃度的重組蛋白免疫血清(1:5、1:50、1:100、1:200及1:500),37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)至30h,觀察肌幼蟲(chóng)存活的情況,計(jì)算死亡率,觀察r Ts GST免疫血清介導(dǎo)的抗體依賴的細(xì)胞毒作用(ADCC)。6.Ts GST與寄生蟲(chóng)及模式生物GST的進(jìn)化關(guān)系分析在Gen Bank搜索并保存其它生物GST的氨基酸序列,利用MEGA6.0軟件構(gòu)建進(jìn)化樹(shù),構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)遵從最佳簡(jiǎn)約原則,根據(jù)進(jìn)化樹(shù)分析Ts GST與其他物種的進(jìn)化關(guān)系。選取旋毛蟲(chóng)屬中的本土旋毛蟲(chóng)(T.nativa)和偽旋毛蟲(chóng)(T.pseudospiralis)以及血吸蟲(chóng)屬中的曼氏血吸蟲(chóng)和日本血吸蟲(chóng)的GST氨基酸序列,利用Clustal W軟件對(duì)氨基酸序列進(jìn)行氨基酸序列的相似性分析。7.r Ts GST的酶活性及其性質(zhì)分析GST具有催化還原性谷胱甘肽GSH與2,4二硝基苯CDNB結(jié)合的能力,其結(jié)合產(chǎn)物的光吸收峰值波長(zhǎng)為340nm,通過(guò)測(cè)定340nm處吸光度上升速率,計(jì)算出GST的酶活力。r Ts GST酶在不同溫度和不同p H值的反應(yīng)條件下,觀察該酶反應(yīng)的最佳溫度和p H值,以及金屬離子與其他試劑對(duì)酶活性的影響。結(jié)果1.ELISA結(jié)果顯示,r Ts GST免疫血清與旋毛蟲(chóng)可溶抗原產(chǎn)生陽(yáng)性反應(yīng);Western blot發(fā)現(xiàn),抗r Ts GST血清可識(shí)別旋毛蟲(chóng)可溶性抗原及純化的r Ts GST,均在24 k Da處顯示明顯條帶,表明r Ts GST具有較強(qiáng)的抗原性,且Ts GST是旋毛蟲(chóng)可溶性抗原的組分。2.RT-PCR分析結(jié)果表明,Ts GST基因在旋毛蟲(chóng)感染性幼蟲(chóng)、成蟲(chóng)、新生幼蟲(chóng)和肌幼蟲(chóng)4個(gè)時(shí)期均有表達(dá);Western blot顯示Ts GST蛋白在旋毛蟲(chóng)各個(gè)蟲(chóng)期都有表達(dá)。IFA結(jié)果顯示,r Ts GST免疫血清能夠與旋毛蟲(chóng)不同發(fā)育時(shí)期的蟲(chóng)體發(fā)生陽(yáng)性反應(yīng)(顯現(xiàn)黃綠色熒光);蟲(chóng)體組織切片IFA結(jié)果顯示Ts GST主要位于蟲(chóng)體的皮層、桿狀體和生殖原基部位。3.r Ts GST蛋白免疫小鼠后可以產(chǎn)生抗Ts GST的高滴度抗體,誘導(dǎo)產(chǎn)生了以Th2免疫反應(yīng)為主的免疫反應(yīng)(表現(xiàn)為高水平的Ig G1)。旋毛蟲(chóng)攻擊感染后,r Ts GST免疫小鼠的成蟲(chóng)和肌幼蟲(chóng)減蟲(chóng)率分別為35.71%和38.55%。4.r Ts GST免疫血清體外對(duì)旋毛蟲(chóng)侵入IEC具有明顯的抑制作用,r Ts GST免疫血清、感染血清及正常血清3組的幼蟲(chóng)侵入率分別31.0%,11.36%及78.96%(χ2=46.4,P0.05)。ADCC實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,免疫血清組的蟲(chóng)體死亡率70%,明顯高于正常血清組的12%(χ2=69.048,P0.001),蟲(chóng)體死亡率具有抗體劑量依賴性(χ2=173.332,P0.001)。5.進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn),Ts GST與旋毛蟲(chóng)屬中的本土旋毛蟲(chóng)和偽旋毛蟲(chóng)GST的進(jìn)化最近,與人類GST的進(jìn)化關(guān)系最遠(yuǎn)。氨基酸序列相似性比對(duì)結(jié)果顯示,Ts GST氨基酸序列與本土旋毛蟲(chóng)、偽旋毛蟲(chóng)、曼氏血吸蟲(chóng)及日本血吸蟲(chóng)的GST氨基酸序列的相似度分別為60%、65%、31%、30%。6.r Ts GST生化性質(zhì)分析結(jié)果顯示,純化后的r Ts GST蛋白具有GST酶活性,最適反應(yīng)條件是溫度為40℃,p H 6.3 7.2。H2O2可完全抑制酶的活性,Mn2+和Na+離子可部分抑制酶的活性,Ca2+、Mg2+和K+離子對(duì)GST酶活性無(wú)明顯影響,但Ni2+離子可將酶活性增加54.7%。結(jié)論1.重組的Ts GST蛋白具有良好的抗原性及GST的酶活性;2.Ts GST在旋毛蟲(chóng)不同發(fā)育期均有轉(zhuǎn)錄與表達(dá),主要定位在蟲(chóng)體的皮層、桿狀體和生殖原基;3.r Ts GST免疫血清在體外對(duì)旋毛蟲(chóng)侵入IEC具有明顯的抑制作用,通過(guò)ADCC作用對(duì)肌幼蟲(chóng)具有明顯的殺傷作用,表明GST是旋毛蟲(chóng)幼蟲(chóng)的侵入相關(guān)蛋白。
【關(guān)鍵詞】：旋毛蟲(chóng) 谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST) 侵入 腸上皮細(xì)胞 免疫保護(hù)
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：Q78;R383.15
【目錄】：

• 摘要5-9
• Abstract9-17
• 英文縮略詞17-19
• 1 前言19-22
• 1.1 旋毛蟲(chóng)感染引起的免疫應(yīng)答19
• 1.2 谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（Glutathione transferase，GST）的功能19-20
• 1.3 GST在寄生蟲(chóng)感染中作用的研究20
• 1.4 研究的內(nèi)容、目的和意義20-22
• 2 材料22-29
• 2.1 主要試劑22
• 2.2 主要儀器22-23
• 2.3 主要試劑的配制23-29
• 3 方法29-48
• 3.1 技術(shù)路線29
• 3.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、旋毛蟲(chóng)蟲(chóng)種及細(xì)胞系29-30
• 3.3 旋毛蟲(chóng)各個(gè)蟲(chóng)期的收集30
• 3.4 旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)ES抗原與各個(gè)蟲(chóng)期可溶性抗原的制備30-31
• 3.5 總RNA的提取31
• 3.6 cDNA反轉(zhuǎn)錄步驟31
• 3.7 引物設(shè)計(jì)31-32
• 3.8 目的基因PCR擴(kuò)增32
• 3.9 重組基因克隆載體的構(gòu)建與鑒定32-36
• 3.10 rTsGST的誘導(dǎo)表達(dá)36
• 3.11 rTsGST的SDS-PAGE分析36-37
• 3.12 rTsGST的可溶性分析37
• 3.13 rTsGST的純化37-38
• 3.14 rTsGST免疫血清的制備38
• 3.15 rTsGST的ELISA鑒定38-39
• 3.16 rTsGST的Western blot鑒定39-40
• 3.17 TsGST基因的轉(zhuǎn)錄與蛋白的表達(dá)鑒定40-41
• 3.18 TsGST蛋白在蟲(chóng)體的具體定位41-43
• 3.19 旋毛蟲(chóng)rTsGST蛋白小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)43-44
• 3.20 rTsGST免疫血清對(duì)旋毛蟲(chóng)影響的體外實(shí)驗(yàn)44-45
• 3.21 TsGST與其他寄生蟲(chóng)和模式生物的進(jìn)化關(guān)系45-46
• 3.22 rTsGST酶性質(zhì)的鑒定46-47
• 3.23 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理47-48
• 4 結(jié)果48-70
• 4.1 TsGST生物信息學(xué)分析48-50
• 4.2 引物設(shè)計(jì)50-51
• 4.3 旋毛蟲(chóng)總RNA的提取51
• 4.4 TsGST基因的PCR擴(kuò)增51-52
• 4.5 TsGST重組質(zhì)粒的構(gòu)建52-55
• 4.6 rTsGST蛋白的SDS-PAGE分析55-57
• 4.7 rTsGST在肌幼蟲(chóng)ES和可溶抗原的免疫學(xué)分析57-59
• 4.8 TsGST基因的轉(zhuǎn)錄水平及翻譯水平鑒定59-60
• 4.9 rTsGST在裸蟲(chóng)蟲(chóng)體的表達(dá)及在組織中具體的定位60-61
• 4.10 rTsGST蛋白體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果61-64
• 4.11 rTsGST免疫血清對(duì)旋毛蟲(chóng)影響的體外實(shí)驗(yàn)64-65
• 4.12 rTsGST進(jìn)化樹(shù)和序列比對(duì)分析65-67
• 4.13 rTsGST的生化性質(zhì)分析67-70
• 5 討論70-73
• 5.1 谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）研究70
• 5.2 TsGST的生物信息學(xué)分析70
• 5.3 rTsGST的免疫原性和抗原性的鑒定70-71
• 5.4 rTsGST的體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)71-73
• 6 結(jié)論73-74
• 參考文獻(xiàn)74-78
• 綜述 旋毛蟲(chóng)感染引起的免疫應(yīng)答及谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的研究78-90
• 參考文獻(xiàn)86-90
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷及碩士在讀期間發(fā)表的論文90-91
• 致謝91

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 薛里;王愛(ài)德;;一種大量收集旋毛蟲(chóng)新生幼蟲(chóng)的簡(jiǎn)便方法[J];中國(guó)寄生蟲(chóng)病防治雜志;1993年01期

2 崔晶,王中全,張燈;旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)排泄分泌物中特異性診斷抗原的研究[J];中國(guó)寄生蟲(chóng)學(xué)與寄生蟲(chóng)病雜志;2003年05期

  本文關(guān)鍵詞：旋毛蟲(chóng)谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的克隆表達(dá)及鑒定，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：261165