本文關(guān)鍵詞：三氯生對母胎界面滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲的影響及其分子機(jī)制的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景：胚胎滋養(yǎng)細(xì)胞在胚胎植入和胎盤發(fā)育的過程中起著至關(guān)重要的作用,胚胎植入時,滋養(yǎng)細(xì)胞粘附并侵入母體子宮內(nèi)膜,最終形成胎盤。胚胎植入后,滋養(yǎng)細(xì)胞利用侵襲完成對子宮螺旋動脈的重塑,為胎兒與母體之間的物質(zhì)交換與氧氣運(yùn)輸提供基礎(chǔ),保障胎兒正常發(fā)育。一旦滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲能力下降,就可能導(dǎo)致胚胎著床失敗、先兆子癇(pre-eclampsia)、自發(fā)流產(chǎn)(spontaneous abortion)以及胚胎發(fā)育受損。滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲主要受到細(xì)胞因子、趨化因子、整合素(integrin)以及基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)的調(diào)控。其中,基質(zhì)金屬蛋白酶能夠降解滋養(yǎng)細(xì)胞外基質(zhì)的絕大多數(shù)成分,為滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲掃清障礙。另一方面,母胎界面的免疫耐受能使胎兒免受母體的免疫排斥,其中蛻膜免疫細(xì)胞在維持免疫耐受的過程中起著重要的作用。巨噬細(xì)胞在母胎界面中主要極化為M2型巨噬細(xì)胞,分泌高水平的抑制性細(xì)胞因子IL-10,低表達(dá)前炎性細(xì)胞因子IL-1β,有利于維持免疫耐受及妊娠。大量證據(jù)顯示,三氯生(triclosan, TCS)可能與妊娠早期胚胎植入失敗、妊娠中后期胚胎發(fā)育不良以及流產(chǎn)相關(guān)。TCS是一類環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(Environmental Endocrine Disruptors, EEDs),在日常生活中廣泛存在。由于具有廣譜抗菌的作用,TCS經(jīng)常被添加于牙膏、肥皂以及洗發(fā)水等日常生活用品中。TCS的結(jié)構(gòu)與雌激素非常類似,它能夠模擬雌激素結(jié)合雌激素受體(estrogen receptor, ER)進(jìn)入細(xì)胞,并通過影響母體雌激素和甲狀腺激素的表達(dá)和分泌來影響胎兒的發(fā)育。不過,三氯生影響胚胎植入以及自發(fā)流產(chǎn)的相關(guān)分子機(jī)制目前尚不清楚。目的：研究TCS對母胎界面滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲的影響及其相關(guān)分子機(jī)制；研究TCS對妊娠中期蛻膜巨噬細(xì)胞極化的影響,為EEDs導(dǎo)致的病理性妊娠的預(yù)防和治療提供新的策略和思路。方法：1.總體設(shè)計：為了研究TCS對胚胎植入期的影響,我們首先建立TCS誘導(dǎo)的小鼠植入期流產(chǎn)模型,觀察TCS對于小鼠胚胎植入的影響。然后通過細(xì)胞侵襲實驗觀察TCS是否能在體外影響人絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞系HTR-8/SVneo的侵襲；通過細(xì)胞劃痕實驗觀察TCS能否影響HTR-8/SVneo細(xì)胞的遷移。接下來,我們在體內(nèi)體外分別檢測在TCS的刺激下,調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲的基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2和MMP-9的表達(dá)是否受到影響。在體外檢測信號通路相關(guān)分子的磷酸化水平,推測TCS通過哪條信號通路影響MMPs的表達(dá)進(jìn)而影響滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲；使用SOCS3 siRNA沉默SOCS3基因的表達(dá),激活JAK2/STAT3信號通路,再通過侵襲實驗確認(rèn)TCS是否仍能影響滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲,并檢測MMPs的表達(dá),從而確認(rèn)TCS是否通過抑制JAK2/STAT3信號通路的激活下調(diào)MMPs的表達(dá)進(jìn)而影響滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲。此外,為了研究TCS對妊娠中期的影響,我們首先建立了TCS誘導(dǎo)的小鼠妊娠中期胚胎流產(chǎn)模型,觀察TCS對于胚胎中期孕鼠自發(fā)流產(chǎn)率的影響；并從孕鼠子宮中分離蛻膜組織,在mRNA水平上檢測蛻膜組織中M1型和M2型巨噬細(xì)胞相關(guān)分子的表達(dá)。2.TCS對孕鼠胚胎植入的影響將6-8周性成熟的ICR雌鼠與雄鼠合籠,分別于每天早晨8：00及晚上8：00檢查雌鼠陰道栓,檢栓陽性記為孕0.5天,將孕鼠隨機(jī)設(shè)置DMSO對照和TCS處理組,連續(xù)灌胃至孕4.5天。在孕5.5天時用臺盼藍(lán)對孕鼠進(jìn)行尾靜脈注射,之后頸椎脫臼處死,取小鼠子宮,統(tǒng)計小鼠的胚胎植入數(shù)。3.TCS對滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲的影響將HTR-8/SVneo細(xì)胞懸液加入鋪有基質(zhì)膠的小室中,置于24孔板內(nèi),每孔加適量完全培養(yǎng)基。TCS處理24小時后,結(jié)晶紫染色,用正置顯微鏡觀察小室中侵襲的滋養(yǎng)細(xì)胞并進(jìn)行計數(shù)。4.TCS對滋養(yǎng)細(xì)胞遷移的影響通過細(xì)胞劃痕實驗來驗證TCS是否能夠抑制HTR-8/SVneo細(xì)胞的遷移。5.TCS對子宮基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)的影響從孕鼠體內(nèi)分離得到子宮,提取其組織蛋白,使用蛋白質(zhì)印跡法(Western blotting, WB)方法檢測母胎界面基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2和MMP-9的表達(dá)。6.TCS對滋養(yǎng)細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶等調(diào)控分子表達(dá)的影響使用Western blotting檢測TCS處理后HTR-8/SVneo細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2、MMP-9、粘附分子CD146和整合素integrinβ1的表達(dá)情況。7.TCS對滋養(yǎng)細(xì)胞部分信號通路的影響使用Western blotting分別檢測TCS處理HTR-8/SVneo后ERK1/2、AKT和JAK2/STAT3的磷酸化情況；并檢測JAK2/STAT3通路的抑制蛋白SOCS3的表達(dá)情況。分別用ERK1/2和AKT的抑制劑與TCS同時處理HTR-8/SVneo, Western blotting檢測MMP-2的表達(dá)；將SOCS3 siRNA轉(zhuǎn)染入HTR-8/SVneo細(xì)胞,Western blotting檢測SOCS3、p-STAT3以及MMP-2的表達(dá),侵襲實驗檢測TCS對滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲的影響。8.TCS對妊娠中期孕鼠流產(chǎn)率的影響將6-8周性成熟的ICR雌鼠與雄鼠合籠,分別于每天早晨8：00及晚上8：00檢查雌鼠陰道栓,檢栓陽性記為孕0.5天,隨機(jī)設(shè)置DMSO對照和TCS處理組,連續(xù)灌胃至孕14.5天。在孕15.5天時將孕鼠頸椎脫臼處死,取小鼠子宮,統(tǒng)計小鼠的胚胎流產(chǎn)率。9.TCS對妊娠中期巨噬細(xì)胞極化的影響Q-PCR檢測孕15.5天孕鼠蛻膜組織中TNF-α、IL-6、IL-1p、CD206、IL-10以及Yml mRNA水平的表達(dá)。結(jié)果：TCS能夠顯著降低孕鼠的胚胎著床率,并下調(diào)子宮基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2的表達(dá)。細(xì)胞侵襲實驗證明,TCS能夠顯著影響滋養(yǎng)細(xì)胞的自發(fā)侵襲；細(xì)胞劃痕實驗證明,TCS能夠顯著影響滋養(yǎng)細(xì)胞的遷移。在體外,TCS也能夠顯著提高M(jìn)MP-2的組織抑制劑TIMP-1和TIMP-2的表達(dá),降低滋養(yǎng)細(xì)胞MMP-2的表達(dá)。TCS能夠顯著激活滋養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)ERK和AKT的磷酸化,同時通過促進(jìn)SOCS3的表達(dá)抑制JAK2/STAT3信號通路激活。使用SOCS3 siRNA沉默滋養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)SOCS3的表達(dá),可以恢復(fù)TCS對滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲的抑制,同時也恢復(fù)了MMP-2的表達(dá)。在妊娠中期TCS能夠顯著提高孕鼠胚胎流產(chǎn)率,并提高M(jìn)1型巨噬細(xì)胞相關(guān)分子TNF-α、IL-6、IL-1p的表達(dá),降低M2型巨噬細(xì)胞相關(guān)分子CD206的表達(dá)。結(jié)論：在胚胎植入期,TCS能夠通過促進(jìn)JAK2/STAT3通路抑制蛋白SOCS3的表達(dá)抑制JAK2/STAT3信號通路的激活,下調(diào)MMP-2的表達(dá),從而影響滋養(yǎng)細(xì)胞的自發(fā)侵襲,最終導(dǎo)致孕鼠胚胎著床率的下降。而在妊娠中期,TCS可以通過改變巨噬細(xì)胞的極化,破壞免疫耐受,進(jìn)而導(dǎo)致孕鼠流產(chǎn)的發(fā)生。
【關(guān)鍵詞】：TCS 滋養(yǎng)細(xì)胞 細(xì)胞侵襲 基質(zhì)金屬蛋白酶 巨噬細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R321
【目錄】：

• 中文摘要5-13
• 參考文獻(xiàn)10-13
• Abstract13-18
• 第一部分 TCS對母胎界面滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲的影響18-47
• 前言18-21
• 材料和方法21-35
• 結(jié)果35-44
• 討論44-47
• 第二部分 TCS對妊娠中期巨噬細(xì)胞極化的影響47-63
• 前言47-50
• 材料和方法50-57
• 結(jié)果57-60
• 討論60-63
• 參考文獻(xiàn)63-70
• 綜述70-84
• 參考文獻(xiàn)75-84
• 附錄84-86
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表文章情況86-87
• 致謝87

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  本文關(guān)鍵詞：三氯生對母胎界面滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲的影響及其分子機(jī)制的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：250943