本文關(guān)鍵詞：脂肪細(xì)胞特異性核酸適配體的篩選、分子識(shí)別及應(yīng)用初探　出處：《中南大學(xué)》2012年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：目的：本研究建立3T3-L1脂肪細(xì)胞分化模型,采用細(xì)胞的指數(shù)級(jí)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment, cell-SELEX)針對(duì)分化成熟的3T3-L1脂肪細(xì)胞進(jìn)行文庫(kù)篩選,并獲得能識(shí)別脂肪細(xì)胞表面膜結(jié)構(gòu)的核酸適配體(Aptamer)。 方法：設(shè)計(jì)并合成隨機(jī)序列DNA文庫(kù),分別用異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)及生物素biotin標(biāo)記引物。將3T3-L1前脂肪細(xì)胞通過(guò)雞尾酒方法誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞分化,選用分化成熟的3T3-L1細(xì)胞作為正篩選細(xì)胞,而未分化的前體3T3-L1及HepG2作為負(fù)細(xì)胞,將文庫(kù)與正負(fù)細(xì)胞反復(fù)孵育進(jìn)行篩選,與正細(xì)胞結(jié)合文庫(kù)采用聚合酶鏈法擴(kuò)增并用作下輪篩選及鑒定。使用流式細(xì)胞技術(shù)對(duì)文庫(kù)的富集程度進(jìn)行監(jiān)測(cè),鑒定。采用454測(cè)序方法對(duì)富集文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序,合成相關(guān)序列并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行鑒定。 結(jié)果：使用傳統(tǒng)的雞尾酒方法成功建立了脂肪細(xì)胞分化模型,通過(guò)應(yīng)用cell-SELEX對(duì)分化成熟的脂肪細(xì)胞展開篩選,經(jīng)過(guò)19輪正負(fù)篩選成功富集到針對(duì)分化成熟3T3-L1脂肪細(xì)胞的ssDNA文庫(kù),經(jīng)過(guò)測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)了4條核酸適體與該脂肪細(xì)胞有結(jié)合,分別命名為Adipo-2, Adipo-4, Adipo-5及Adipo-8 結(jié)論：通過(guò)CELL-SELEX技術(shù)針對(duì)脂肪細(xì)胞進(jìn)行篩選,可以獲得與靶細(xì)胞高親和性的核酸適配體 目的：在第一部分實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上對(duì)篩選出針對(duì)脂肪細(xì)胞表面的核酸適配體進(jìn)行特異性分析、解離常數(shù)測(cè)定及不同條件對(duì)其結(jié)合性能的影響,以進(jìn)一步了解所篩選的核酸適配體的結(jié)合特性。 方法：合成篩選的核酸適配體,與不同系統(tǒng)來(lái)源的細(xì)胞進(jìn)行結(jié)合試驗(yàn),采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)其結(jié)合性能進(jìn)行鑒定；將核酸適體稀釋成不同濃度后與分化成熟3T3-L1脂肪細(xì)胞進(jìn)行孵育,使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同濃度核酸適體的結(jié)合能力,并計(jì)算各核酸適體的解離常數(shù);采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了核酸適體在不同溫度孵育,胰島素刺激靶細(xì)胞及核酸適體不同截短方案對(duì)其結(jié)合性能影響。 結(jié)果：核酸適體Adipo1和Adipo8均能與脂肪細(xì)胞結(jié)合,而對(duì)其它系統(tǒng)來(lái)源的細(xì)胞幾乎沒(méi)有結(jié)合性能。解離常數(shù)測(cè)定提示Adipo8, Adipo-1能與脂肪細(xì)胞高親和力、高特異性結(jié)合,所測(cè)Kd值分別為17.5+5.1nM和97.5±13.5nM。4℃和37℃孵育條件對(duì)所測(cè)核酸適體的結(jié)合沒(méi)有影響。Adipo8與分化成熟脂肪的3T3-L1脂肪細(xì)胞的結(jié)合能被trpsin及protienase K消化液消化,而Adipo1則不受影響。經(jīng)過(guò)500nM胰島素處理對(duì)Adipo1和Adipo8與分化成熟的脂肪細(xì)胞的結(jié)合幾乎沒(méi)有影響。 結(jié)論：核酸適配體Adipo8對(duì)分化成熟的脂肪細(xì)胞顯示出良好的結(jié)合性及高度特異性,Adipo8可能的靶標(biāo)為脂肪細(xì)胞表面某種與胰島素作用不相關(guān)的膜蛋白,但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。 目的：前述細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明,核酸適體Adipo8在體外顯示出針對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞的結(jié)合特異性,本部分實(shí)驗(yàn)通過(guò)大鼠冰凍組織切片進(jìn)一步證實(shí)其特異性,探討使用該核酸適配體用于監(jiān)測(cè)脂肪細(xì)胞分化程度,流式分選分化成熟脂肪細(xì)胞及體內(nèi)應(yīng)用。 方法：雄性SD大鼠頸椎脫位法處死后,取附睪脂肪組織,肝臟骨骼肌及胰腺組織制成石蠟切片或直接冰凍切片。冰凍切片時(shí),取上述新鮮組織用OCT包埋置于-20℃低溫恒溫器迅速冷凍后,切成10μm薄片,貼片后用4℃預(yù)冷的丙酮室溫下固定15min,用PBS洗后采用HE染色及疫光核酸適配體染色。染色切片置于熒光顯微鏡下觀察,比較兩種方法處理組織時(shí)核酸適體對(duì)其結(jié)合情況；通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)核酸適配體及對(duì)照文庫(kù)對(duì)不同分化階段的脂肪細(xì)胞的結(jié)合程度,探討兩者相對(duì)熒光強(qiáng)度與分化時(shí)間的相關(guān)性,采用流式細(xì)胞儀對(duì)與核酸適配體結(jié)合部分的脂肪細(xì)胞進(jìn)行分選；將核酸適配體用cy5標(biāo)記后將其經(jīng)尾靜脈注射入SD大老鼠,生理鹽水灌注后取不同組織進(jìn)行熒光檢測(cè)以確定核酸適體的靶向性。 結(jié)果：核酸適配體Adipo-8與S-D大鼠冰凍附睪脂肪組織切片孵育后顯示出很強(qiáng)的熒光信號(hào),而冰凍肝臟,骨骼肌,胰腺組織與核酸適配體孵育后無(wú)熒光信號(hào)。對(duì)照核酸適體文庫(kù)與大鼠冰凍附睪脂肪組織孵育未觀察到熒光信號(hào)。核酸適體Adipo-8與對(duì)照文庫(kù)的相對(duì)熒光強(qiáng)度與脂肪細(xì)胞分化時(shí)間呈正相關(guān)。Adipo-8經(jīng)尾靜脈注射到活體大鼠體內(nèi)后未能在外周組織中觀察到特異熒光信號(hào)。 結(jié)論：核酸適配體Adipo8能特異性與冰凍切片處理的脂肪組織及原代分離的大鼠脂肪細(xì)胞結(jié)合。核酸適配體可用來(lái)監(jiān)測(cè)3T3-L1脂肪細(xì)胞分化程度及分化成熟脂肪細(xì)胞的分離。Adipo8可以用來(lái)發(fā)現(xiàn)脂肪細(xì)胞膜上特異性生物標(biāo)記物及為可能開發(fā)出脂肪組織特異性藥物靶向治療載體提供理論基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R329

【共引文獻(xiàn)】

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4 劉U，

本文編號(hào)：1355161