本文關(guān)鍵詞：NR1-TfR融合表位疫苗的制備及免疫反應的實驗研究　出處：《瀘州醫(yī)學院》2012年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：目的：谷氨酸N－甲基－D－天冬氨酸受體(N-Methyl-D-Asparate Receptor，NR)廣泛參與神經(jīng)發(fā)育、突觸可塑性、學習記憶、缺血性腦損傷和癲癇等生理病理過程，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中起著重要作用。目前己知的NR拮抗劑或阻斷劑大部分是人工合成的小分子藥物，容易通過血腦屏障（Blood-brain barrier,BBB）；但其作用選擇性低、常引起嚴重毒副作用：意識模糊、焦慮不安、幻覺等，并且難以超早期用藥，因此難以進入臨床。NR1是NR的基本功能亞單位，，具有NR的所有電生理和藥理學特性�？罐D(zhuǎn)鐵蛋白受體的單克隆抗體OX26被認為是迄今最有前途的腦轉(zhuǎn)運載體，NR1抗體借助轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（Transferrin receptor,TfR）可能可以透過血腦屏障在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮干預治療作用。因此NR1-TfR重組基因口服疫苗有望成超早期治療腦損傷、機體應激、疼痛等的可行方法之一。本研究擬用前期實驗構(gòu)建的NR1-TfR單克隆表位的優(yōu)勢克隆融合蛋白表達載體pcDNA3.1-NR1/TFR（vector-S）制備NR1-TfR重組基因表位疫苗，SD大鼠口服免疫后研究該疫苗在正常大鼠體內(nèi)的免疫反應。方法：（1）vector-S在真核細胞HEK293內(nèi)的正確表達：vector-S轉(zhuǎn)染HEK293細胞，細胞免疫熒光和western-blot分析細胞表達產(chǎn)物，鑒定vector-S在HEK293細胞內(nèi)的正確表達；（2）制備NR1-TfR融合表位疫苗：vector-S經(jīng)電穿孔方法轉(zhuǎn)入減毒鼠傷寒沙門桿菌（SL7207）,經(jīng)Amp抗性篩選、基因測序確定vector-S成功轉(zhuǎn)入SL7207內(nèi)，由此獲得含vector-S的細菌SL7207（命名為SL7207-S）。OD600≈0.8時運用平板菌落計數(shù)方法計數(shù)SL7207-S的細菌含量，以此制備0.5X109cfu/ml、1X109cfu/ml疫苗單位的口服疫苗；（3）NR1-TfR融合表位疫苗在SD大鼠體內(nèi)的免疫反應的研究：SD大鼠按實驗要求經(jīng)灌胃法口服疫苗，兩周內(nèi)共免疫四次。在此期間觀察各組大鼠生長狀態(tài)，有無腹瀉、死亡等現(xiàn)象。取小腸組織（空腸）進行免疫組織化學分析腸道粘膜免疫反應；以HEK293穩(wěn)定表達的vector-S蛋白作為已知抗原，細胞免疫熒光分析檢測血清和腦脊液中抗體的表達�？诜庖咭粋�月后檢測抗體在體內(nèi)持續(xù)存在的情況；結(jié)果：1）以商品化抗體NR1、OX26作為一抗，細胞免疫熒光檢測轉(zhuǎn)染了vector-S的細胞HEK293可顯示紅色熒光；western-blot檢測其細胞產(chǎn)物在marker2KD-8KD范圍內(nèi)見有目的條帶；2) SL7207-S菌種質(zhì)粒S經(jīng)基因測序證實其氨基酸序列與vector-S序列一致,平板菌落計數(shù)當OD600≈0.8時SL7207-S細菌含量為1.6X107cfu/ml;3)各組大鼠口服疫苗后生長狀態(tài)良好，未見腹瀉、死亡等現(xiàn)象；4）小腸免疫組織化學結(jié)果示空白組腸道粘膜細胞內(nèi)無棕色物質(zhì)表達，而NR1-TfR-1組（0.5X109cfu/ml）、NR1-TfR-2組(1X109cfu/ml)均有棕色物質(zhì)表達；5）細胞免疫熒光結(jié)果顯示空白對照組大鼠血清、腦脊液作為一抗時HEK293未顯示出紅色熒光；NR1-TfR-1組、2組血清作為一抗時HEK293均顯示出紅色熒光；NR1-TfR-1組腦脊液作為一抗時HEK293無紅色熒光而NR1-TfR-2組顯示出紅色熒光，6）免疫一個月后重復檢測方法顯示NR1-TfR-2組腸道粘膜細胞內(nèi)仍有棕色物質(zhì)表達；NR1-TfR-1組血清作為一抗HEK293紅色熒光顯示較弱，而NR1-TfR-2組血清、腦脊液作為一抗HEK293紅色熒光仍明顯存在；結(jié)論：1）vector-S在真核細胞HEK293內(nèi)能正確表達其目的蛋白，符合后續(xù)動物實驗設計要求；2）成功獲得SL7207-S菌種并制備所需的兩種疫苗單位的口服疫苗；3）NR1-TfR口服疫苗在SD大鼠體內(nèi)口服安全，無明顯的細菌毒副作用；4）NR1-TfR重組疫苗成功啟動SD大鼠腸道粘膜免疫系統(tǒng)；5）兩種濃度的口服疫苗均能誘導大鼠產(chǎn)生循環(huán)抗體anti-NR1抗體，1x109cfu/ml的NR1-TfR重組疫苗產(chǎn)生的抗體可透過血腦屏障進入腦脊液；6）anti-NR1抗體在腸道粘膜細胞、血清和腦脊液內(nèi)至少持續(xù)存在一個月以上；
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【學位授予單位】：瀘州醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R392.11

【參考文獻】

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本文編號：1355053