第一章 緒論  

1.1  氟喹諾酮類抗生素（FQs） 
FQs 是一大類人工合成的抗生素藥物，具有抗菌活性強(qiáng)、組織滲透性高、交叉耐藥性弱等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于泌尿生殖系統(tǒng)和下呼吸道系統(tǒng)等細(xì)菌感染疾病的治療。從 20 世紀(jì) 80 年代開始至今，F(xiàn)Qs 藥物已經(jīng)發(fā)展到第四代，包括諾氟沙星(NOR)、環(huán)丙沙星（CIP）、克林沙星（CLI）、加替沙星(GAT)等。其中，環(huán)丙沙星是目前廣泛應(yīng)用的 FQs 中抗菌活性最強(qiáng)者，其抗菌活性均較依諾沙星及諾氟沙星強(qiáng) 2~4 倍。 FQs 的基本結(jié)構(gòu)為  4-氟喹諾酮酸，在其喹諾酮環(huán)上均含有氟原子，其結(jié)構(gòu)骨架如圖 1-1 所示[1]。C-3 上的羧酸和 C-4 上的吡啶酮是 FQs 的主要官能團(tuán)，主要與細(xì)菌細(xì)胞 DNA 促旋酶結(jié)合，從而抑制細(xì)胞 DNA 復(fù)制；C-6 上的氟原子能夠加強(qiáng)喹諾酮分子與 DNA 促旋酶的結(jié)合，增強(qiáng)喹諾酮對(duì)細(xì)胞組織的滲透力。N-1上的取代基主要影響 FQs 的抗菌譜；當(dāng) R2取代基為哌嗪環(huán)時(shí)，F(xiàn)Qs 就同時(shí)含有堿性基團(tuán)哌嗪基和酸性基團(tuán)羧基，屬于兩性化合物。大部分 FQs 不溶于石油醚、四氯化碳和氯仿，能溶于甲醇、氰甲烷、乙腈，難溶于水，易溶于冰醋酸，稀酸性和稀堿性溶液。通常情況下，溫度、pH 和光照對(duì)大部分 FQs 的穩(wěn)定性影響較小，但小部分 FQs 對(duì)光敏感。由于含有苯并雜環(huán)結(jié)構(gòu)和羧基、羥基等基團(tuán)生成的共軛體系，F(xiàn)Qs 分子在紫外光區(qū) 240~300nm 和 320~360nm 處均有吸收峰。FQs 是我國(guó)使用最廣泛的幾類抗生素之一，主要通過口服和注射方式使用。這類物質(zhì)進(jìn)入人體和動(dòng)物體內(nèi)后，只有小部分能被機(jī)體吸收，70%仍以原形及其降解產(chǎn)物被排出體外，這類廢水最終進(jìn)入污水處理廠進(jìn)行集中處理。然而，現(xiàn)有的廢水處理工藝對(duì) FQs的去除效果有限，導(dǎo)致仍有一部分FQs進(jìn)入自然環(huán)境中，給環(huán)境生態(tài)安全帶來潛在的危害。
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1.2 FQs 的耐藥機(jī)制 
由于人們不規(guī)范地使用抗生素，使得這類活性物質(zhì)通過各種途徑不斷進(jìn)入環(huán)境中，造成其―假持續(xù)‖的表象。長(zhǎng)期暴露在低劑量的抗生素環(huán)境中，微生物會(huì)在環(huán)境選擇壓力下對(duì)抗生素產(chǎn)生抗藥性。歐洲抗菌藥消費(fèi)監(jiān)督委員會(huì)（European Surveillance  for  Antimicrobial  Consumption）發(fā)現(xiàn)在 2007~2010 年間，微生物對(duì)FQs 的抗藥性有明顯的增加趨勢(shì)[2]。 通常，微生物對(duì)抗生素產(chǎn)生抗藥性可以分為外因與內(nèi)因。內(nèi)因是位于微生物染色體上的基因發(fā)生突變引起，這種也叫做固有抗藥性，能夠通過生長(zhǎng)繁殖保留下來。外因是通過質(zhì)粒、整合子等遺傳因子載體進(jìn)行抗性基因的水平轉(zhuǎn)移。目前，微生物的抗藥性主要是通過質(zhì)粒等載體的水平基因轉(zhuǎn)移獲得�；虻乃睫D(zhuǎn)移加快了抗性基因的擴(kuò)散，，使抗性基因在不同微生物種之間傳播，甚至導(dǎo)致多重耐藥性微生物的出現(xiàn)。具有這些抗性基因的微生物可能通過各種途徑進(jìn)入人體，對(duì)人類及生態(tài)健康安全具有重大的危害。微生物對(duì) FQs 的抗藥機(jī)制主要有質(zhì)粒介導(dǎo)喹諾酮耐藥（plasmid-mediated  quinolone  resistance）和染色體介導(dǎo)喹諾酮耐藥（quinolone resistance-determining region）。 
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第二章  環(huán)丙沙星在曝氣生物濾池（BAF）中的污染行為特征   

2.1  曝氣生物濾池系統(tǒng)裝置平臺(tái)的搭建及其穩(wěn)定運(yùn)行 
曝氣生物濾池工藝是目前世界上應(yīng)用最為廣泛的污水處理工藝之一，其具備占地面積小、處理負(fù)荷高、基建投資少等優(yōu)勢(shì)。最初，BAF 的主要功能是去除有機(jī)物和截留固體物質(zhì)。近年來，  BAF 處理技術(shù)得到了廣泛的發(fā)展，被應(yīng)用于屠宰場(chǎng)和造紙工業(yè)的廢水處理[61]。目前，BAF 在我國(guó)還處于推廣階段[62]，它主要與微污染水處理和污水的深度處理。隨著研究的深入，BAF 也同其他污水處理技術(shù)結(jié)合直接用于二級(jí)處理。 本研究采用 BAF 處理含有 CIP 的生活污水，研究曝氣生物濾池硝化（反硝化）處理 CIP，以及 CIP 對(duì) BAF 中硝化反應(yīng)的影響。同時(shí)研究其對(duì)細(xì)菌微生物的抗性基因的形成及抗性菌群變遷的影響。 BAF 工藝基本原理如下：濾池中裝有比表面積較大的濾料，污水在通過濾池時(shí)在濾料表面生長(zhǎng)以微生物為主的生物膜。生物膜上微生物能夠利用污水中的C、N 等營(yíng)養(yǎng)元素進(jìn)行新陳代謝，而使污水得以快速凈化。同時(shí)，生物膜的絮凝作用和壓實(shí)狀態(tài)的濾料截留了污水中大量的懸浮物。隨著系統(tǒng)的運(yùn)行，不斷生長(zhǎng)的生物膜和截留下的 SS 使濾料層的空隙持續(xù)減少，系統(tǒng)的水頭損失開始持續(xù)增大至嚴(yán)重影響系統(tǒng)的運(yùn)行，甚至出水水質(zhì)變差，這時(shí)需要對(duì)濾料層進(jìn)行反沖洗，以更新生物膜和釋放截留的固體物質(zhì)。系統(tǒng)進(jìn)行反沖洗后又開始進(jìn)入高效運(yùn)行階段。 實(shí)驗(yàn)裝置設(shè)計(jì)如圖  2-1 所示。BAF 為一圓形有機(jī)玻璃柱，柱高 116cm，內(nèi)徑8cm，填料層高度為 90cm；在濾池上部設(shè)有溢流口與反沖洗排水口，底部設(shè)有處理進(jìn)水口和反沖洗進(jìn)水口；距濾池底端  10cm 設(shè)有曝氣管，曝氣管前段設(shè)有曝氣頭。BAF  以沸石為填充濾料。沸石由鞏義市晟鑫水處理材料有限公司提供，沸石容重 1.4kg/m3，表觀密度  1.8~2.2kg/m3，比表面積≥500m2/g，空隙率≥50%，鹽酸可溶率<0.1%，抗壓強(qiáng)度>4MPa，摩擦損失率<0.5%。 
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2.2 實(shí)驗(yàn)試劑 

CIP（純度為 99%），NOR（純度為 98%），均購(gòu)自百靈威公司。甲醇、乙腈為色譜純，購(gòu)自美國(guó) Sigma-Aldrich 公司。碳酸鈉、碳酸氫鈉、鹽酸、氫氧化鈉、磷酸和乙二胺四乙酸二鈉（Na2EDTA）均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。實(shí)驗(yàn)所需溶液的配制方法如下： （1）CIP 貯備液：精確量取 CIP 標(biāo)準(zhǔn)品 100mg 于 100mL 容量瓶中，配制成 CIP的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，濃度為 1g/L，置于 4?C 冰箱保存。使用時(shí)，用高純水稀釋到所需濃度。 （2）NOR 貯備液：精確量取 NOR 標(biāo)準(zhǔn)品 20mg 于 100mL 容量瓶中，配制成 CIP的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，濃度為 200mg/L，置于 4?C 冰箱保存。使用時(shí)，用高純水稀釋到指定濃度。 （3）Na2CO3標(biāo)準(zhǔn)液：準(zhǔn)確稱取 19.08g Na2CO3于 500ml 燒杯中，充分溶解用去離子水定容至 500mL，得 0.36mol/L 的 Na2CO3儲(chǔ)備液。準(zhǔn)確吸取 10ml  Na2CO3儲(chǔ)備液用超純水稀釋定容至 1000mL 容量瓶，即為 3.6mmol/L 的 Na2CO3標(biāo)準(zhǔn)液 （4）NaHCO3標(biāo)準(zhǔn)液：準(zhǔn)確稱取 25.22g Na2CO3于 500ml 燒杯中，充分溶解用去離子水定容至 500mL，得 0.6mol/L 的 Na2CO3儲(chǔ)備液。準(zhǔn)確吸取 10ml  Na2CO3儲(chǔ)備液用超純水稀釋定容至 1000mL 容量瓶，即為 6.0mmol/L 的 Na2CO3標(biāo)準(zhǔn)液 （5）NO2-標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取 0.1848g 的 KNO2于 100ml 燒杯中，充分溶解用去離子水定容至 100mL，得 1000mg/L 的 NO2-儲(chǔ)備液。 （6）NO3-標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取 0.1629g  的 KNO3于 100ml 燒杯中，充分溶解用去離子水定容至 100mL，得 1000mg/L 的 NO2-儲(chǔ)備液。 （7）流動(dòng)相儲(chǔ)備液液：用純水配制 0.025mol/L  磷酸溶液，用三乙胺調(diào)節(jié) pH=2.5后定容至 500mL，將配制好的 0.025mol/L  磷酸溶液同 HPLC 純的乙腈以體積比50:50 進(jìn)行混合，混合液即為流動(dòng)相儲(chǔ)備液。 

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第三章   CIP-ARGs 在 BAF 中的行為特征及演變規(guī)律 ......... 30 
3.1   實(shí)驗(yàn)材料 .......... 30 
3.1.1   實(shí)驗(yàn)試劑........ 30 
3.1.2   儀器設(shè)備........ 30 
3.1.3   緩沖液的配制 ....... 31
3.2   實(shí)驗(yàn)方法 .......... 31
3.3   結(jié)果與討論 ...... 35     
3.3.1  生物膜中 CIR-ARGs 的檢測(cè) ........ 35     
3.3.2  出水中 CIR-ARGs 的檢測(cè)..... 38         
3.3.3 CIP 與 CIP-ARGs 相關(guān)性分析 ...... 40
3.4  本章小結(jié) .......... 41 
第四章   BAF 生物膜中微生物群落的研究 ....... 43 
4.1   實(shí)驗(yàn)用品 .......... 43
4.2   實(shí)驗(yàn)方法 .......... 44
4.3   結(jié)果與討論 ...... 49
4.4   本章小結(jié) .......... 55 
第五章   結(jié)論與建議 ...... 57 
5.1   結(jié)論 .......... 57 
5.2  展望 .... 58 

4.4   本章小結(jié)

本章主要討論了 DO、CIP、氨氮對(duì)生物膜中微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)論如下： 
（1）高通量測(cè)序結(jié)果表明，曝氣生物濾池中優(yōu)勢(shì)菌屬為 Proteobacteria、Bacteroidetes。其中，運(yùn)行初期的曝氣生物濾池中優(yōu)勢(shì)菌屬還包括 Cyanobacteria。此外，檢測(cè)出的優(yōu)勢(shì)微生物中都不包括反硝化細(xì)菌（在屬的水平），這與 BAF 中較差的反硝化作用應(yīng)相符合 
（2）入水氨氮的不同造成 BAF 中微生物群落結(jié)構(gòu)的差異。2#BAF 中微生物豐度高于 3#BAF，但 3#BAF 中微生物多樣性高于 2#BAF。2 組 BAF 中參與硝化過程的主要微生物為亞硝酸菌屬（Nitrosomonas）和硝化螺旋菌屬（Nitrospira）。同時(shí)數(shù)據(jù)表明，3 號(hào)中 Nitrosomonas、Nitrospira 豐度均高于 2 號(hào)樣品，這與 3#BAF具有更高的硝化負(fù)荷相一致。 
（3）DO 從 5~6mg/L 下降至 1.5~2.5mg/L 時(shí)，BAF 中微生物豐度差別不大，但微生物多樣性有所增大。Desulfobacter、  Zoogloea  、Dechloromonas 是 BAF 中三個(gè)最主要的菌屬。DO 下降后，Acinetobacter  、Arcobacter  、Sulfuricurvum 的豐度明顯降低，而 Flavobacterium、Thauera、Arenimonas 的豐度明顯上升。 
（4）投加不同濃度 CIP 對(duì) BAF 中微生物群落結(jié)構(gòu)有較大的影響，微生物的多樣性隨著CIP濃度增大先下降后上升。BAF中優(yōu)勢(shì)菌屬為變形菌門（Proteobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes）。投加 50μg/L 的 CIP 后，硝化螺旋菌屬（Nitrospirae）的豐度有所下降，但繼續(xù)增加 CIP 濃度對(duì)其沒有明顯作用。而藍(lán)藻門（Cyanobacteria）的豐度在投加 CIP 后明顯下降，表明其對(duì) CIP 的存在較敏感。此外，高濃度 CIP 對(duì)綠菌門（Chlorobi）  和綠彎菌門（Chloroflexi）沒有抑制作用，使得其豐度上升。  
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結(jié)論

本文以曝氣生物濾池作為研究對(duì)象，考察了 DO、C/N、CIP 的初始濃度對(duì)BAF 中 COD 去除和硝化作用影響，同時(shí)檢測(cè)其對(duì) CIP 的去除作用，采用熒光定量 PCR 方法定量檢測(cè)分析了 4 種 CIP-ARGs 在此過程中的豐度變化，并采用PCR-DGGE 結(jié)合高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè) BAF 中微生物群落結(jié)構(gòu)的變化。主要研究結(jié)論如下： 
（1）當(dāng) DO 下降時(shí)，3 組 BAF 中 COD 的去除率分別平均下降了 9.99%、9.54%、11.64%，但有機(jī)物仍可得到較好的去除。而 3 組 BAF 中氨氮平均去除率分別下降 51.8%、51.9%、34.2%，出水中 NH4+-N、NO2-和 NO3-濃度有明顯變化，表明DO 的改變對(duì)硝化作用有極大的抑制作用。此外，2 組裝置中 CIP 去除率明顯開始下降，其平均去除率分別下降了 7.9%、9.2%。 
（2）C/N 增大后，BAF 中 COD 去除率都有所增大，COD 去除率上升了17.69%~18.66%。同時(shí)，BAF 出水中 NH4+-N、NO2-和 NO3-濃度也有不同程度的改變。出水 NH4+-N，NO2-濃度都有所下降，而出水 NO3-濃度則增大，C/N 值增大在一定程度上促進(jìn)了硝化反應(yīng)的進(jìn)行。同時(shí)，CIP 的去除率隨入水 C/N 值增大而有所增大，但增幅較小。 
（3）當(dāng)進(jìn)水 CIP 濃度為 0~300μg/L 時(shí)，3 組 BAF 中 COD 的去除效果相對(duì)穩(wěn)定。投加 50μg/L 的 CIP，BAF 中硝化過程基本沒有影響。但 CIP 濃度增大到 300μg/L時(shí)，NH4+-N 出水濃度增大，表明高濃度 CIP 對(duì)氨氧化過程有抑制。同時(shí)，CIP的去除率隨著投加 CIP 升高而略有減少。此外，在整個(gè)系統(tǒng)運(yùn)行期間中，3#BAF中的 CIP 去除率都高于 2#BAF，表明硝化反應(yīng)有利于 CIP 的生物降解率。此外，BAF 中的 TN 去除率較低，反硝化反應(yīng)較弱，基本可以不考慮反硝化作用。 
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參考文獻(xiàn)(略)

本文編號(hào)：62024