摘要

目的:采用正交設(shè)計法初步建立巨菌草的組培技術(shù)體系，包括外植體的選擇及消毒、培養(yǎng)基配方、培養(yǎng)條件、愈傷誘導、幼苗分化、生根、煉苗移栽等方面，利用該優(yōu)化的組培體系，，采用農(nóng)桿菌介導法，轉(zhuǎn)入耐寒基因ICE1，探索巨菌草的轉(zhuǎn)基因體系，為巨菌草的遺傳改良奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 正交設(shè)計法，優(yōu)化，組培

Abstract

objective: using orthogonal design method to establish a seed giant JunCao technology system, including the choice of explant and disinfection, formula of culture medium, culture conditions, callus induction and differentiation, rooting seedling, seedling transplanting smelting, etc., by using the optimized transformation system, adopts the method of agrobacterium mediated, turn into cold resistant gene ICE1, explore the giant JunCao system of genetically modified (gm), lay a foundation for giant JunCao genetic improvement.

Keywords: orthogonal design method, optimization and transformation

 
1 引言

巨菌草隸屬單子葉植物禾本科狗尾草屬，是一種適宜在熱帶、亞熱帶、溫帶生長和人工栽培的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)菌草�？勺鳛樵耘嘞愎�、靈芝等49種食用菌、藥用菌的培養(yǎng)料，同時還可作為飼料及水土保持的優(yōu)良草種，目前也被用于生物發(fā)電、制造燃料乙醇、水質(zhì)凈化等能源和環(huán)保用途。巨菌草屬于典型的四碳植物，具有很高的光合速率，且粗蛋白含量很高。因此，巨菌草的遺傳改良對發(fā)展菌業(yè)、畜牧業(yè)、能源業(yè)等具有十分重要的意義。
近幾年，巨菌草的利用發(fā)展很快，已在我國南方大面積栽培，但在北方因無法越冬而推廣受到限制。長期以來，巨菌草的品種選育基本上依靠常規(guī)育種方法，無法解決巨菌草耐寒性改良的問題。植物基因工程技術(shù)的發(fā)展為巨菌草的耐寒性遺傳改良提供了一種很有潛力的手段。自細胞全能性理論提出以來，在無數(shù)科學家的努力下，植物組織培養(yǎng)技術(shù)經(jīng)過近百年的發(fā)展歷程后已經(jīng)日趨完善和成熟。單子葉尤其是禾本科植物的組織培養(yǎng)一直是個難點，無論愈傷組織的誘導還是再分化體系的建立，單子葉植物都比雙子葉植物困難得多。近幾年來禾本科模式植物水稻的農(nóng)桿菌介導的粳稻遺傳轉(zhuǎn)化體系已日趨成熟，為單子葉植物的組織培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化提供很好的技術(shù)基礎(chǔ)。
植物的耐寒基因是由多基因控制的數(shù)量性狀，因此單獨改變某一個或幾個耐寒基因?qū)χ仓昴秃缘奶岣邲]多大影響。ICE1基因是在低溫時誘導CBF表達的一個轉(zhuǎn)錄激活因子，ICE1基因在低溫時能特定地結(jié)合到CBF3的啟動子序列上，誘導CBF3的表達，擬南芥中的CBF3能刺激四十多種脅迫誘導基因的表達，如rd29，cor15A，cor47等（Michael F et al., 2001; Viswanathan C et al., 2003）。Viswanathan C等（2003）已得到了含耐寒基因ICE1的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株，與未轉(zhuǎn)基因擬南芥植株相比，轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的耐寒能力顯著提高。將ICE1基因構(gòu)建到含強啟動子35S的載體中，然后轉(zhuǎn)基因可能培育出耐寒植物品種。
完整的巨菌草組織培養(yǎng)體系和轉(zhuǎn)基因體系是對巨菌草進行遺傳改良的前提和技術(shù)保障。巨菌草是由福建省福建農(nóng)林大學菌草研究所所長、菌草技術(shù)發(fā)明人林占禧研究員于1983年引進中國，經(jīng)過20多年培育出適合我國氣候土壤環(huán)境的草種，并由林占禧研究員命名。目前國內(nèi)未見有關(guān)巨菌草組織培養(yǎng)體系和轉(zhuǎn)基因的報道。本研究擬參照其他禾本科植物如水稻、甘蔗等組織培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化方法，研究并建立一套完整的巨菌草組織培養(yǎng)體系和轉(zhuǎn)基因體系，為巨菌草的進一步遺傳改良提供技術(shù)基礎(chǔ)，為巨菌草的抗寒育種提供新的途徑。

2 材料與方法
2.1材料
2.1.1實驗材料
鮮嫩的巨菌草（福建農(nóng)林大學大學菌草所提供）
2.1.2組培室及各種實驗儀器的消毒
（一）植物組織培養(yǎng)室的滅菌 
1、地面、墻壁和工作臺的滅菌：用2%新潔爾滅噴霧。 
（1）配方：取新潔爾滅原液20ml，加水980ml，配成2%新潔爾滅溶液。 
（2）方法：將配好的2%新潔爾滅溶液倒入噴霧器內(nèi)，進行均勻噴霧。 
（3）注意事項： 
  ①墻壁、角落、地面噴霧要均勻，不要遺漏； 
  ②注意安全，在噴房頂時，要特別小心，防止藥液霧滴掉入眼睛。 
2、無菌室和培養(yǎng)室的滅菌：用甲醛和高錳酸鉀熏蒸，1年中熏蒸1-2次。 
（1）配方：每立方米空間用甲醛10ml加高錳酸鉀5g的配比液熏蒸。 
（2）方法：首先房子要密封。然后在房子中間放一口缸或大燒杯，將稱好的高錳酸鉀放入缸內(nèi)，再把已稱量的甲醛溶液慢慢倒入缸內(nèi)，完畢，人迅速離開，并關(guān)上門，密封3天。 
（3）注意事項： 
  ①操作前要戴好口罩及手套； 
  ②倒入甲醛時要小心，因為甲醛遇到高錳酸鉀會迅速沸騰，并產(chǎn)生大量煙霧。操作時人要迅速避開煙霧； 
  ③3天后，打開房間，搬走費液缸；一周后，方可進入操作。 
3、在已經(jīng)熏蒸過的房間內(nèi)，用70%酒精紗布擦洗培養(yǎng)架、工作臺。 
4、用紫外燈照射20—30min。 
5、使用前，再用70%酒精噴霧，使空間灰塵落下。
（二）培養(yǎng)基的滅菌——高壓蒸汽滅菌（濕熱滅菌法） 
（1）洗滌：把組織培養(yǎng)基用的培養(yǎng)皿、三角瓶、試管等玻璃器皿進行徹底清洗。自然晾干或烘箱干燥。 
（2）包扎：用牛皮紙、報紙、紗布或錫箔紙把玻璃器皿和金屬器械分別包扎好。 
（3）裝水：在高壓滅菌鍋內(nèi)裝入一定量的水（水要淹沒電熱絲）。（切忌干燒�。� 
（4）裝物品：在滅菌鍋內(nèi)放入含培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶或三角瓶、裝蒸餾水的玻璃瓶，以及包扎好的玻璃器皿和金屬器械等。 
（5）滅菌：將排氣閥開著，加熱，直至鍋內(nèi)釋放出大量水蒸氣（此時水蒸氣橫向噴出），再關(guān)閉閥們；或者當鍋內(nèi)壓力升至49.0KPa時，開啟排氣閥，將鍋內(nèi)的冷空氣全部排出。當鍋內(nèi)壓力達到108KPa時，溫度為121℃時，維持15-20分鐘，即可達到滅菌的目的。（若滅菌時間過長，會使培養(yǎng)基中的某些成分變性失效。）切斷電源，讓滅菌鍋自然冷卻。 
注意：①先打開放氣閥，再打開鍋蓋。（以免鍋內(nèi)壓力大而爆炸�。� 
       ②開蓋后應(yīng)盡快轉(zhuǎn)移培養(yǎng)瓶，使培養(yǎng)瓶冷卻、凝固。一般應(yīng)將滅菌后的培養(yǎng)瓶儲藏于30℃以下的室內(nèi)，最好儲藏在4-10℃的條件下。 
        ③某些生長調(diào)節(jié)劑如IAA、ZT、ABA等以及某些維生素遇熱是不穩(wěn)定的，不能同培養(yǎng)基一起高壓滅菌，而需要進行過濾滅菌。 
2.1.3外植體的準備及消毒
選取幼嫩且生長良好的狼尾草莖稈，剝除葉鞘，用刀割下腋芽和頂芽 ( 注意盡量減少對腋芽的損害) ，將腋芽和頂芽置于紗布中，乙醇清洗→無菌水清洗→2%NaClO 浸泡10分鐘→無菌水清洗三到四次。
2.1.4培養(yǎng)基的制備
將以下各成分混合，定容至 1000mL，調(diào) pH至 5. 8，見表 1。
按 20mL/瓶分裝到加有激素的三角瓶中，121℃，滅菌 20min，備用。

3 采用不同防褐化物質(zhì)對愈傷組織誘導的影響
很多種類的植物體中含有大量多酚類化合物，切取芽時的創(chuàng)傷會激活組織中的多酚氧化酶，將多酚類物質(zhì)氧化為棕褐色的醌類物質(zhì)，使外植體的切口處發(fā)生褐變，并會滲透到培養(yǎng)基中，使培養(yǎng)基褐化，其結(jié)果是嚴重影響培養(yǎng)物的生長和分化，甚至造成培養(yǎng)物死亡。
影響褐變的因素很多，植物的種類褐基因型、外植體的來源和生理狀況以及培養(yǎng)基的成分都會不同程度的影響褐變的程度。一般木本植物的外植體比較容易產(chǎn)生褐變現(xiàn)象，在成年樹尤其嚴重。培養(yǎng)基中含酚過高會導致褐變，含過高濃度的無機鹽和肌醇也會加劇外植體的褐變。6-芐氨基嘌呤（6-BA）和激動素（KT）也有誘導褐化的作用。強光和高溫同樣會促進褐化現(xiàn)象。
為了防止外植體的褐變，我們采用不同濃度的AC，PVP等防褐化物質(zhì)在
相同培養(yǎng)基的情況下觀察出愈率。如表1
表1
處理 基本培養(yǎng)基 防褐化物質(zhì) 濃度
（mg/L) 出愈率 5%顯著水平 1%極顯
著水平
III1 MS+2,4-D+NAA+KT AC 0.1 2.96% c B
III2 MS+2,4-D+NAA+KT AC 0.2 1.85% c B
III3 MS+2,4-D+NAA+KT AC 0.3 4.81% c B
III4 MS+2,4-D+NAA+KT PVP 0.5 58.52% b A
III5 MS+2,4-D+NAA+KT PVP 1.0 76.30% a A
III6 MS+2,4-D+NAA+KT PVP 1.5 55.93% ab A

4 正交測驗
正交試驗設(shè)計是研究多因素多水平的又一種設(shè)計方法它是根據(jù)正交性從全面試驗中挑選出部分有代表性的點進行試驗這些有代表性的點具備了“均勻分散齊整可比”的特點正交試驗設(shè)計是分析因式設(shè)計的主要方法是一種高效率、快速、經(jīng)濟的實驗設(shè)計方法。
激素對植物生長影響很大，激素濃度是組織培養(yǎng)研究的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，我們采用了 2,4-D、KT 和NAA 作為巨菌草外植體誘導的組合，并研究了不同濃度的激素組合對外植體的生長情況的影響
基本培養(yǎng)基： MS
   三因素：2,4-D 濃度：A1（1.0mg/）, A2（2.0mg/L）, A3（3.0mg/L）
           NAA濃度：B1（0.1mg/L）, B2（0.2mg/L）, B3（0.3mg/L）
            KT濃度：C1（0.5mg/L）, C2（1.0mg/L）, C3（1.5mg/L）, 
   采用L9(34)設(shè)計。組合搭配：
A1B1C1 A1B2C2 A1B3C3
A2B1C2 A2B2C3 A2B3C1
A3B1C3 A3B2C1 A3B3C2
共9個處理每個處理接3瓶，每瓶5塊外植體，3次生物學重復（時間重復），統(tǒng)計愈傷率，方差分析，差異顯著性測驗，確定最佳激素組合。
表1 L9(33)正交表
處理號 1 2 3
1 1 1 1
2 1 2 2
3 1 3 3
4 2 2 1
5 2 3 2
6 2 1 3
7 3 3 1
8 3 1 2
9 3 2 3
表2 正交實驗設(shè)計巨菌草愈傷組織誘導結(jié)果
處理編號 基本培養(yǎng)基 2,4-D（mg/L) IAA（mg/L) KT（mg/L) 出愈率 0.05 0.01
I1 MS 1.0 0.1 0.5 14.81% cd BCD
I2 MS 1.0 0.2 1.0 70.37% a A
I3 MS 1.0 0.3 1.5 11.11% d CD
I4 MS 2.0 0.2 0.5 31.48% b B
I5 MS 2.0 0.3 1.0 27.78% bc BC
I6 MS 2.0 0.1 1.5 27.78% bc BC
I7 MS 3.0 0.3 0.5 7.41% d D
I8 MS 3.0 0.1 1.0 18.52% bcd BCD
I9 MS 3.0 0.2 1.5 18.52% bcd BCD
表3 方差分析
變異來源 平方和 自由度 均方 F值
區(qū)組 0.0144 2 0.0072
2,4-D 0.1529 2 0.0765 11.8942
IAA 0.3073 2 0.1536 23.8982
KT 0.2496 2 0.1248 19.4145
誤差 0.1029 16 0.0064
總和 0.9588
   
圖1  巨菌草幼莖愈傷組織

5 不同培養(yǎng)基對巨菌草愈傷組織誘導的影響
培養(yǎng)基（Medium）是供微生物、植物和動物組織生長和維持用的人工配制的養(yǎng)料，一般都含有碳水化合物、含氮物質(zhì)、無機鹽（包括微量元素）以及生長素和水等。有的培養(yǎng)基還含有抗菌素、色素、激素和血清。本實驗采用四種不同的培養(yǎng)基MS，B5，N6，NB來反映不同的培養(yǎng)基對巨菌草組織又到的影響。
處理 基本培養(yǎng)基 激素
1 MS 2,4-D + NAA + KT
2 B5 2,4-D + NAA + KT
3 N6 2,4-D + NAA + KT
4 NB 2,4-D + NAA + KT
     共4個處理，每個處理接3瓶，每瓶5塊外植體，3次生物學重復（時間重復），統(tǒng)計愈傷率，方差分析，差異顯著性測驗，確定最佳激素組合。
表4
處理 基本培養(yǎng)基 激素 出愈率 5%顯著水平 1%極顯著水平
II1 MS 2,4-D（1.0mg/L) + NAA (0.2mg/L)+ KT(1.0mg/L) 66.67% a A
II2 B5 2,4-D（1.0mg/L) + NAA (0.2mg/L)+ KT(1.0mg/L) 52.96% ab AB
II3 N6 2,4-D（1.0mg/L) + NAA (0.2mg/L)+ KT(1.0mg/L) 37.78% bc B
II4 NB 2,4-D（1.0mg/L) + NAA (0.2mg/L)+ KT(1.0mg/L) 27.78% c B

6 結(jié)果與分析
植物組織培養(yǎng)過程中，外植體消毒處理難，易污染是最常見的問題。我們以巨菌草腋芽、頂芽作為外植體，研究了不同的消毒處理以及不同的消毒時間對外植體染菌量的影響。通過對外植體消毒的實驗可以發(fā)現(xiàn)，絕大部分大的腋芽都染菌了; 經(jīng)過 75% 乙醇處理的幼嫩外植體都褐化比較嚴重，生長活力比較低，部分幼芽可能死亡，可能是酒精濃度過高外植體比較嫩的原因; 從實驗結(jié)果看，對小嫩芽和頂芽的消毒不需要用酒精處理，只用2%次氯酸鈉處理 10min 左右比較好，對于比較大的腋芽，則需要先使用酒精處理，次氯酸鈉的濃度也可以適當提高一些，盡量避免交叉污染。在植物組織培養(yǎng)中，外植體接種成功與否，主要取決于外植體的選取和消毒時間。當消毒時間超過一定程度時就會出現(xiàn)接種材料致死而變黑的現(xiàn)象，導致染菌率升高和成苗率降低。酒精溶液有很強的穿透力，一般消毒時間應(yīng)控制在2min 以內(nèi)。在生產(chǎn)上應(yīng)對外植體進行徹底消毒并執(zhí)行嚴格的無菌操作，盡可能多地獲得無菌外植體，為建立起初次培養(yǎng)無菌體系奠定基礎(chǔ)。組織培養(yǎng)快速繁殖省去了誘導愈傷組織步驟，直接誘導芽分化，大大縮短了誘導時間，而且可以減少種苗變異率。通過巨菌草不同激素及濃度組合后外植體的生長情況 �？梢园l(fā)現(xiàn)結(jié)果部分符合理論以及前人在無菌外植體建立實驗中的結(jié)果，即高濃度的細胞分裂素有利于芽的生長。
7 討論

8 結(jié)論

參考文獻
 
致  謝
在論文完成之際，我要特別感謝我的指導老師鄭燕老師的熱情關(guān)懷和悉心指導。在我撰寫論文的過程中，老師傾注了大量的心血和汗水，無論是在論文的選題、構(gòu)思和資料的收集方面，還是在論文的研究方法以及成文定稿方面，我都得到了老師悉心細致的教誨和無私的幫助，特別是他廣博的學識、深厚的學術(shù)素養(yǎng)、嚴謹?shù)闹螌W精神和一絲不茍的工作作風使我終生受益，在此表示真誠地感謝和深深的謝意。 在論文的寫作過程中，也得到了許多同學的寶貴建議，同時還到許多在工作過程中許多同事的支持和幫助，在此一并致以誠摯的謝意。 感謝所有關(guān)心、支持、幫助過我的良師益友。 最后，向在百忙中抽出時間對本文進行評審并提出寶貴意見的各位專家表示衷心地感謝！






                                              作者：
                                             2014年4月 30日

本文編號：855525