昆蟲病原線蟲共生菌中Ⅲ型分泌系統(tǒng)的功能研究
發(fā)布時間：2021-11-12 18:50
昆蟲病原線蟲共生菌是一類與線蟲共生的革蘭氏陰性細菌,包括發(fā)光桿菌屬（Photorhabdus spp.）和致病桿菌屬（Xenorhabdus spp.）。在自然界中,這類細菌主要存在于線蟲體內(nèi),可以分泌多種毒力因子幫助線蟲殺死昆蟲。研究表明,III型分泌系統(tǒng)（T3SS）是病原菌分泌毒力因子的關(guān)鍵分泌系統(tǒng),而T3SS在昆蟲病原線蟲共生菌中的功能機制尚未闡明。前期研究中,課題組從Photorhabdus luminescens TT01菌株中克隆了T3SS合成基因簇,并將接合轉(zhuǎn)移元件重組至重組質(zhì)粒中,為在Xenorhabdus stockiae HNxs01中異源表達T3SS奠定了基礎(chǔ)。本研究通過接合轉(zhuǎn)移的方式將攜帶P.luminescens TT01菌株T3SS合成基因簇的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入HNxs01菌株中,全基因組掃描表明:P.luminescens TT01菌株T3SS合成基因簇成功整合至HNxs01菌株染色體上。與野生型菌株相比,重組菌株HNxs01-T3SS對樅色卷蛾中腸細胞CF-203的侵襲能力...
【文章來源】：湖南師范大學(xué)湖南省 211工程院校
【文章頁數(shù)】：74 頁
【學(xué)位級別】：碩士
【部分圖文】：
XopA蛋白與副溶血弧菌中VopA效應(yīng)蛋白相似性分析
碩士學(xué)位論文32第三章結(jié)果和分析3.1攜帶T3SS基因簇的重組菌株的構(gòu)建及鑒定將從PhotorhabdusluminescensTT01中克隆到的T3SS合成基因簇通過接合轉(zhuǎn)移的方式轉(zhuǎn)移到XenorhabdusstockiaeHN_xs01中，通過PCR擴增T3SS基因簇相應(yīng)目的條帶進行檢測。以接合子的基因組為模板，進行PCR擴增，獲得目的片段大小分別為1010bp，876bp，793bp（圖3-1），與預(yù)期一致，表明攜帶T3SS合成基因簇的重組菌株構(gòu)建成功。同時，通過全基因組掃描，證實T3SS合成基因簇成功整合到HN_xs01染色體上。圖3-1PCR擴增T3SS基因簇片段Fig3-1AmplificationproductsofT3SSgeneclusterM:DL2000;1-3:以T3SS-1-F/T3SS-1-R為引物;4-6:以T3SS-2-F/T3SS-2-R為引物;7-9:以T3SS-3-F/T3SS-3-R為引物;10:以srfA-F/srfA-R為引物3.2重組菌株的殺蟲活性分析取不同濃度的重組菌株HN_xs01-T3SS和野生型菌株HN_xs01對棉鈴蟲四齡幼蟲進行血腔注射，注射重組菌株和野生型菌株72h后，觀察棉鈴蟲四齡幼蟲的生長狀況。注射重組菌株和野生型菌株后，部分棉鈴蟲四齡幼蟲均出現(xiàn)體表黑化，蟲體生長受到抑制的現(xiàn)象，且最終受試昆蟲死亡（圖3-2A）；但在不同的菌株注射濃度下，注射重組菌株的棉鈴蟲四齡幼蟲的死亡率顯著高于注射野生型菌株組（圖3-2B），說明T3SS增強了HN_xs01菌株的殺蟲活性。
昆蟲病原線蟲共生菌中III型分泌系統(tǒng)的功能研究33圖3-2重組菌株和野生型菌株對棉鈴蟲四齡幼蟲的注射毒力Fig3-2TheinjectabletoxicityagainstH.armigerafourthinstarlarvaA:棉鈴蟲四齡幼蟲的形態(tài)變化；B:72h后棉鈴蟲四齡幼蟲的死亡率(n=3,**p<0.01,***p<0.001)3.3重組菌株對昆蟲細胞的侵襲測定將含mCherry標簽的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入重組菌株和野生型菌株中，在倒置熒光顯微鏡下觀察重組菌株和野生型菌株均攜帶紅色熒光，說明質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入（圖3-3）。將重組菌株和野生型菌株與CF-203細胞共孵育2h后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察重組菌株和野生型菌株均能侵入CF-203細胞（圖3-4）。在不同的MOI（10，20，30）下，將細菌與CF-203細胞共孵育2h后，檢測侵入細胞中的細胞數(shù)，結(jié)果顯示：在不同的感染復(fù)數(shù)下，重組菌株侵入CF-203細胞的細菌數(shù)均高于野生型菌株組，且MOI為20時侵入細胞的細菌數(shù)量最多（表3-1和3-2），說明T3SS能提高HN_xs01的侵襲能力。圖3-3紅色熒光蛋白mCherry標記HN_xs01和HN_xs01-T3SSFig3-3mCherrylabeledHN_xs01andHN_xs01-T3SSAB
【參考文獻】：
期刊論文
[1]革蘭陰性菌分泌系統(tǒng)及其分泌產(chǎn)物研究進展[J]. 余樂正,柳鳳娟,鄢南南,程旭,李益洲,郭延芝. 動物醫(yī)學(xué)進展. 2017(08)
[2]從嗜線蟲桿菌分離的吲哚衍生物抗腫瘤活性的研究[J]. 呂秋軍,簡恒,劉衛(wèi)京,楊秀芬,溫利青,陳媛媛,郭紹明,曲艷燕,董俊興. 中國新藥雜志. 2002(11)
本文編號：3491472
【文章來源】：湖南師范大學(xué)湖南省 211工程院校
【文章頁數(shù)】：74 頁
【學(xué)位級別】：碩士
【部分圖文】：
XopA蛋白與副溶血弧菌中VopA效應(yīng)蛋白相似性分析
碩士學(xué)位論文32第三章結(jié)果和分析3.1攜帶T3SS基因簇的重組菌株的構(gòu)建及鑒定將從PhotorhabdusluminescensTT01中克隆到的T3SS合成基因簇通過接合轉(zhuǎn)移的方式轉(zhuǎn)移到XenorhabdusstockiaeHN_xs01中，通過PCR擴增T3SS基因簇相應(yīng)目的條帶進行檢測。以接合子的基因組為模板，進行PCR擴增，獲得目的片段大小分別為1010bp，876bp，793bp（圖3-1），與預(yù)期一致，表明攜帶T3SS合成基因簇的重組菌株構(gòu)建成功。同時，通過全基因組掃描，證實T3SS合成基因簇成功整合到HN_xs01染色體上。圖3-1PCR擴增T3SS基因簇片段Fig3-1AmplificationproductsofT3SSgeneclusterM:DL2000;1-3:以T3SS-1-F/T3SS-1-R為引物;4-6:以T3SS-2-F/T3SS-2-R為引物;7-9:以T3SS-3-F/T3SS-3-R為引物;10:以srfA-F/srfA-R為引物3.2重組菌株的殺蟲活性分析取不同濃度的重組菌株HN_xs01-T3SS和野生型菌株HN_xs01對棉鈴蟲四齡幼蟲進行血腔注射，注射重組菌株和野生型菌株72h后，觀察棉鈴蟲四齡幼蟲的生長狀況。注射重組菌株和野生型菌株后，部分棉鈴蟲四齡幼蟲均出現(xiàn)體表黑化，蟲體生長受到抑制的現(xiàn)象，且最終受試昆蟲死亡（圖3-2A）；但在不同的菌株注射濃度下，注射重組菌株的棉鈴蟲四齡幼蟲的死亡率顯著高于注射野生型菌株組（圖3-2B），說明T3SS增強了HN_xs01菌株的殺蟲活性。
昆蟲病原線蟲共生菌中III型分泌系統(tǒng)的功能研究33圖3-2重組菌株和野生型菌株對棉鈴蟲四齡幼蟲的注射毒力Fig3-2TheinjectabletoxicityagainstH.armigerafourthinstarlarvaA:棉鈴蟲四齡幼蟲的形態(tài)變化；B:72h后棉鈴蟲四齡幼蟲的死亡率(n=3,**p<0.01,***p<0.001)3.3重組菌株對昆蟲細胞的侵襲測定將含mCherry標簽的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入重組菌株和野生型菌株中，在倒置熒光顯微鏡下觀察重組菌株和野生型菌株均攜帶紅色熒光，說明質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入（圖3-3）。將重組菌株和野生型菌株與CF-203細胞共孵育2h后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察重組菌株和野生型菌株均能侵入CF-203細胞（圖3-4）。在不同的MOI（10，20，30）下，將細菌與CF-203細胞共孵育2h后，檢測侵入細胞中的細胞數(shù)，結(jié)果顯示：在不同的感染復(fù)數(shù)下，重組菌株侵入CF-203細胞的細菌數(shù)均高于野生型菌株組，且MOI為20時侵入細胞的細菌數(shù)量最多（表3-1和3-2），說明T3SS能提高HN_xs01的侵襲能力。圖3-3紅色熒光蛋白mCherry標記HN_xs01和HN_xs01-T3SSFig3-3mCherrylabeledHN_xs01andHN_xs01-T3SSAB
【參考文獻】：
期刊論文
[1]革蘭陰性菌分泌系統(tǒng)及其分泌產(chǎn)物研究進展[J]. 余樂正,柳鳳娟,鄢南南,程旭,李益洲,郭延芝. 動物醫(yī)學(xué)進展. 2017(08)
[2]從嗜線蟲桿菌分離的吲哚衍生物抗腫瘤活性的研究[J]. 呂秋軍,簡恒,劉衛(wèi)京,楊秀芬,溫利青,陳媛媛,郭紹明,曲艷燕,董俊興. 中國新藥雜志. 2002(11)
本文編號：3491472
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