發(fā)布時間：2020-12-10 13:56

　　木材資源對于整個人類社會具有不可缺少的重要意義。木材作為燃燒能源以及在造紙和建筑方面具有不可缺少的重要地位,樹木的大部分生物量是木材,木材也稱次生木質部。次生生長過程中維管形成層向內分化產生次生木質部,向外分化產生次生韌皮部,后續(xù)經歷細胞膨脹擴增,次生壁沉積,細胞程序性死亡等一系列復雜發(fā)育過程使樹干增粗,因此植物次生生長的基因調控網絡具有重要的科研價值。本研究通過分析前期的基因表達數據選定LBD基因家族中的LBD21-31（Potri.010G186000）基因為研究對象,以雜交楊樹84K為實驗材料,克隆得到楊樹LBD21-31基因片段,并成功構建35S::LBD21-31過表達載體,使用農桿菌介導的葉盤侵染轉化技術侵染得到LBD21-31過表達轉基因植株,通過RT-qPCR檢測了LBD21-31在不同轉基因植株中的表達量,后續(xù)通過表型分析和植株莖段切片觀察分析了LBD21-31對楊樹愈傷發(fā)育、根系發(fā)育及次生木質部發(fā)育的影響,使用DAP-seq分析了與LBD21-31直接作用的靶基因,為LBD基因家族研究和楊樹良種選育提供了重要的理論依據,現有主要研究結果如下:（1）LBD21-31基... 

【文章來源】：山東農業(yè)大學山東省

【文章頁數】：66 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

楊樹木材形成過程中次生細胞壁轉錄調控網絡Fig.1-1Thetranscriptionalnetworkregulatingsecondarywallbiosynthesisduringwoodformationinpoplar

山東農業(yè)大學碩士學位論文11qPCRMasterMix：購自南京諾唯贊生物科技有限公司；RNA提取試劑盒、DNaseI酶、RNaseI酶：購自寶日醫(yī)生物技術有限公司；DNA產物純化試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、高純度質粒小提試劑盒：購自北京康為世紀生物科技有限公司；限制性內切酶KpnI，XbaI、T4連接酶：購自于賽默飛世爾科技公司（ThermoFisherScientific）。光照培養(yǎng)箱型號GXZ-500C，品牌：寧波江南；小型冷凍高速離心機型號5424R，品牌：Eppendor；PCR儀型號LabcyclerGradient96，品牌：SENSOQUEST；凝膠成像分析儀型號TANON1600R，品牌：上海天能。2.2實驗方法2.2.1LBD21-31過表達載體的構建2.2.1.1LBD21-31基因序列和載體圖譜通過毛果楊基因數據庫（https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）輸入LBD21-31基因號Potri.010G186000查詢得到毛果楊LBD21-31的CDS序列。選取的過表達載體為PzP211+35s+PolyA，載體大小9014bp，其中啟動子為CaMV35S，菌體培養(yǎng)過程中抗性為大觀霉素（Spe），在轉基因植株中抗性為卡那霉素（Kana）。圖2-1PzP211+35S載體圖譜Fig.2-1PzP211+35Svector

山東農業(yè)大學碩士學位論文27IPTG（異丙基-β-D-硫代半乳糖苷）誘導目的蛋白的表達,在離心管中加入2mlLB和2μLAMP抗生素，混合均勻后加入200μL轉化成功的大腸桿菌（DE3）菌液，搖床恒溫37℃條件下180rpm培養(yǎng)24h。準備無菌錐形瓶，在錐形瓶中加入250mlLB和250μLAMP抗生素，混合均勻后加入2ml菌液。搖床恒溫37℃條件下180rpm培養(yǎng)至OD600值約為0.5，15℃條件下靜置30min，加IPTG至0.5mM，15℃條件下誘導24h。將誘導24h之后的蛋白菌液分裝在50ml離心管中，離心機4℃條件下12000g離心5min，離心過程中將錐形瓶置于冰上。離心結束后吸干凈離心管內壁附著的的LB液體，把離心后的菌體連同離心管一同放入-80℃冰箱保存。（3）基因蛋白互作使用磁珠（BeaverBeadsGSH）對蛋白菌液進行純化，詳細步驟見說明書。使用第一步提取的DNA，根據其濃度取100ngDNA加水至40μL。再取定量蛋白磁珠加PBS溶液至40μL，與40μL的DNA溶液混勻后制成80μL反應液。在20℃恒溫150rpm條件下晃動1h。結合完成后將離心管置于磁力架上，等待吸附完成后棄上清液，保留沉淀。將沉淀使用PBST緩沖液洗五遍后，更換新的離心管，使用27μLEB懸浮沉淀，水浴鍋98℃水浴10min。水浴完成后置于冰上冷卻5min，離心機3000g條件下離心5s，離心管放置磁力架上，吸附完成后吸出上清液，取約25μL作為模板用于PCR擴增。割膠回收DNA后，提交DAP-seq文庫，使用illumina方法進行高通量測序，每個樣品準備了三個重復。圖2-2pCold-GST載體圖譜Fig.2-2pCold-GSTvector

【參考文獻】：
期刊論文
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[2]植物NAC轉錄因子的生物學功能[J]. 張慧珍,白雪芹,曾幼玲.  植物生理學報. 2019(07)
[3]LBD基因家族研究進展[J]. 石玉,沈詩雅,張倩茹,孫振美,鄔榮領,郭允倩.  中國細胞生物學學報. 2019(04)
[4]毛果楊LBD基因家族的全基因組分析[J]. 蘆強,邵芬娟,邱德有.  基因組學與應用生物學. 2018(01)
[5]84K楊愈傷組織再生體系和直接分化再生體系遺傳轉化的比較性研究[J]. 王麗娜,王玉成,楊傳平.  植物研究. 2017(04)
[6]植物MYB轉錄因子功能及調控機制研究進展[J]. 左然,徐美玲,柴國華,周功克.  生命科學. 2012(10)
[7]植物的次生生長及其分子調控[J]. 田敏,夏瓊梅,李紀元.  遺傳. 2007(11)
[8]84K楊再生和遺傳轉化體系的優(yōu)化[J]. 李科友,樊軍鋒,趙忠,周永學,高建社.  西北農林科技大學學報(自然科學版). 2007(07)
[9]84K楊葉片再生系統的建立[J]. 王樹耀,田宗城,黃白紅,徐艷.  湖南文理學院學報(自然科學版). 2004(04)

碩士論文
[1]84K楊再生和遺傳轉化體系的研究[D]. 周熙瑩.東北林業(yè)大學 2013



本文編號：2908808