菊花（Chrysanthemum morifolium Ramat.）是我國十大傳統(tǒng)名花和世界四大鮮切花之一,其栽培面積和產(chǎn)量在各花卉中均居于前列。氮素營養(yǎng)水平通常會(huì)影響菊花的產(chǎn)量和品質(zhì)。硝態(tài)氮（NO3--N）是菊花吸收氮素的主要形式。根系吸收的NO3-經(jīng)過木質(zhì)部導(dǎo)管長途轉(zhuǎn)運(yùn)后主要存儲(chǔ)在葉片液泡中,并能在氮源不足時(shí)將儲(chǔ)存在液泡中的N03-釋放出來供菊花再分配和再利用。因此,了解N03-在菊花葉片液泡中的儲(chǔ)存機(jī)制對(duì)培育氮高效利用率和氮饑餓耐受性高的菊花新品種至關(guān)重要。近年來的研究發(fā)現(xiàn)定位于液泡膜上的CLC家族的一些基因可能參與植物液泡N03-的存儲(chǔ)。但在菊花中關(guān)于這一方面的報(bào)道還比較少。本研究以菊花扦插生根苗‘神馬’為試材,外源N03-水培條件下篩選出液泡NO3-響應(yīng)基因CnCLCa并對(duì)其進(jìn)行功能驗(yàn)證。主要研究內(nèi)容及結(jié)果:1、外源NO3-能誘導(dǎo)菊花CmCLCa的表達(dá)用含有5 mM KN03的Hoagland營養(yǎng)液水培處理（對(duì)照為不含N元素的Hoagland營養(yǎng)液）后,分別在第0、1、4、8、12、16、20和24 h對(duì)液泡NO3-存儲(chǔ)相關(guān)基因CmCLCa-c、CmCLCg進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量... 

【文章來源】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)山東省

【文章頁數(shù)】：65 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

外源NO3-處理對(duì)菊花葉片液泡NO3-存儲(chǔ)相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量的影響

山東農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文下同。Fig.3-1EffectsofexogenousNO3-treatmentontherelativeexpressionlevelsofvacuolarNO3-storage-relatedgenesCmCLCa-candCmCLCginchrysanthemumleavesA:CmCLCa;B:CmCLCb;C:CmCLCc;D:CmCLCg.Dataaremean±SE(n=3).DifferentlowercaselettersonbarsindicatestatisticallysignificantdifferencesinmeanvaluesatP<0.05.Thesameasfollows.3.1.2NO3-處理對(duì)菊花葉片液泡中NO3-含量的影響在本實(shí)驗(yàn)中，我們還測定了外源NO3-（5mMNO3-）處理下菊花葉片液泡內(nèi)NO3-含量的變化（圖3-2）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著處理時(shí)間的延長，菊花葉片液泡NO3-含量不斷增加，并在處理第8h達(dá)到最大值為7.4umolNO3-/umolp-nitrophenol，之后雖有所下降但始終保持在較為穩(wěn)定的狀態(tài)且明顯高于對(duì)照。這一變化趨勢與外源NO3-處理下菊花CmCLCa基因相對(duì)表達(dá)量的變化趨勢一致（圖3-1A）。圖3-2外源NO3-處理對(duì)菊花葉片液泡NO3-含量的影響Fig.3-2EffectofexogenousNO3-treatmentonthevacuolarNO3-contentofchrysanthemumleaves3.2菊花CmCLCa基因的功能鑒定3.2.1農(nóng)桿菌介導(dǎo)的菊花遺傳轉(zhuǎn)化前面的實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)外源NO3-能夠誘導(dǎo)菊花CmCLCa的表達(dá)，同時(shí)液泡中存儲(chǔ)的NO3-含量也顯著增加。我們猜測，液泡中存儲(chǔ)NO3-含量的增加是否與CmCLCa基因相對(duì)表達(dá)量升高有關(guān)？為了進(jìn)一步探究CmCLCa基因與液泡中積累NO3-之間的關(guān)系，我們通過與擬南芥AtCLCa序列比對(duì)獲得了384bp的保守區(qū)域，然后用于在沉默構(gòu)建體中生成RNAi片段，并獲得了CmCLCa-RNAi轉(zhuǎn)基因菊花‘神馬’組培苗（圖3-3）。25

菊花CmCLCa基因的表達(dá)分析及功能驗(yàn)證圖3-3CmCLCa-RNAi轉(zhuǎn)基因‘神馬’組培苗比例尺=1cm。Fig.3-3CmCLCa-RNAitransgenic‘Jinba’tissuecultureseedlingsScalebar:1cm.3.2.2CmCLCa-RNAi轉(zhuǎn)基因菊花的分子鑒定在菊花轉(zhuǎn)基因過程中，當(dāng)分化出的小苗長到約5cm時(shí)，取葉片進(jìn)行分子水平檢測（圖3-4A，B）。半定量PCR結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因系#1，#2，#3在384bp左右有單一且比較清晰明亮的條帶，#5有拖尾現(xiàn)象，#4無條帶。同時(shí)，定量PCR排除了轉(zhuǎn)基因系#1，#2，#3為假陽性菊花苗的可能。因此，我們選擇轉(zhuǎn)基因菊花系#1、#2、#3用于接下來的實(shí)驗(yàn)。圖3-4B為其相對(duì)表達(dá)抑制情況：與WT相比，轉(zhuǎn)基因菊花系#1、#2、#3中CmCLCa的表達(dá)量分別下降了25.1%、32.4%、23.3%。圖3-4CmCLCa-RNAi轉(zhuǎn)基因菊花的分子檢測A：半定量PCR檢測；B：q-RTPCR檢測Fig.3-4ThemoleculardetectionofCmCLCa-RNAitransgenicchrysanthemumA:semi-quantitativePCRdetection;B:quantitativePCRdetection26

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]氮素形態(tài)對(duì)煙草生長及品質(zhì)影響的研究進(jìn)展[J]. 張杰,黃海棠,楊立均,許自成.  中國農(nóng)學(xué)通報(bào). 2018(15)
[2]菊花基因組DNA甲基化水平對(duì)根系硝態(tài)氮吸收的影響[J]. 于媛媛,郭蕓琿,溫立柱,孫翠慧,樊紅梅,孫憲芝,王文莉,孫霞,鄭成淑.  植物生理學(xué)報(bào). 2018(05)
[3]菊花花瓣伸長相關(guān)基因CmXTHs的克隆與功能驗(yàn)證[J]. 溫立柱,孫霞,任紅,樊紅梅,于媛媛,郭蕓琿,鄭成淑.  園藝學(xué)報(bào). 2017(11)
[4]硝態(tài)氮影響菊花根系形態(tài)結(jié)構(gòu)變化的分子基礎(chǔ)[J]. 郭蕓琿,于媛媛,溫立柱,孫翠慧,孫憲芝,王文莉,孫霞,鄭成淑.  中國農(nóng)業(yè)科學(xué). 2017(09)
[5]作物硝態(tài)氮轉(zhuǎn)運(yùn)利用與氮素利用效率的關(guān)系[J]. 張振華.  植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報(bào). 2017(01)
[6]玉米ZmCLCa基因克隆及其對(duì)氮素吸收的功能驗(yàn)證[J]. 曾廷儒,張靜,張登峰,杜金友.  植物遺傳資源學(xué)報(bào). 2017(01)
[7]植物中氮素利用及硝態(tài)氮轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的研究進(jìn)展[J]. 胡春吉,雷寧,鄒良平,彭明.  分子植物育種. 2016(08)
[8]施用氮肥對(duì)油用牡丹葉片氮素吸收積累與籽粒品質(zhì)的影響[J]. 姜天華,單佩佩,黃在范,溫立柱,孫翠慧,劉坤,鄭成淑.  應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào). 2016(10)
[9]玉米CLC家族基因差異表達(dá)及其與NO3-、Cl-吸收之間的關(guān)系[J]. 曾廷儒,張靜,劉書曉,杜金友.  玉米科學(xué). 2016(02)
[10]覆草和氮肥對(duì)蘋果光合作用的影響[J]. 趙慧穎,許彬.  種子世界. 2016(04)

博士論文
[1]MADS-box轉(zhuǎn)錄因子CmANR1調(diào)控菊花根系發(fā)育的機(jī)理研究[D]. 孫翠慧.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 2018
[2]菊花CmNRTs基因的克隆及功能鑒定[D]. 顧春筍.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 2012

碩士論文
[1]鹽地堿蓬SsCLC-1在硝態(tài)氮累積過程中的功能研究[D]. 段會(huì)敏.山東師范大學(xué) 2019
[2]水分脅迫下施加硝態(tài)氮對(duì)葡萄幼苗氮素代謝及相關(guān)酶的影響[D]. 楊夕.石河子大學(xué) 2018
[3]菊花基因組DNA甲基化水平對(duì)根系硝態(tài)氮吸收的影響[D]. 于媛媛.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 2018
[4]菊花根系響應(yīng)硝態(tài)氮的形態(tài)結(jié)構(gòu)和分子基礎(chǔ)[D]. 郭蕓琿.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 2018
[5]玉米CLC基因家族的表達(dá)分析及ZmCLCa基因的功能驗(yàn)證[D]. 曾廷儒.河北科技師范學(xué)院 2016
[6]擬南芥氯離子通道蛋白CLC-c在生長和鹽脅迫中的作用及其在油菜中超表達(dá)[D]. 覃海英.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2013
[7]不同生境鹽地堿蓬對(duì)低濃度硝態(tài)氮的響應(yīng)[D]. 張曉東.山東師范大學(xué) 2013
[8]油菜氮高效種質(zhì)的篩選及高效機(jī)制[D]. 田飛.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2011
[9]氮營養(yǎng)對(duì)切花菊‘優(yōu)香’品質(zhì)影響研究[D]. 楊迎東.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2010
[10]切花菊‘神馬’氮營養(yǎng)研究[D]. 孫凱.北京林業(yè)大學(xué) 2007



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