發(fā)布時間：2020-11-17 06:31

　　 南方水稻黑條矮縮病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)是呼腸孤病毒科(Reoviridae)斐濟病毒屬(Fijivirus)的一個暫定種,由介體昆蟲白背飛虱(Sogatella furcifera)以持久增殖型方式傳播,但不經(jīng)卵傳播。由SRBSDV引發(fā)的南方水稻黑條矮縮病在我國南方稻區(qū)以及越南稻區(qū)等地暴發(fā)流行給水稻生產(chǎn)造成了嚴重的損失。病毒編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白對于病毒在介體昆蟲體內(nèi)的運動、復(fù)制和裝配等起著重要作用。SRBSDV編碼的P5-1、P6和P9-1蛋白是病毒原質(zhì)的組分,參與病毒的復(fù)制和裝配。但是同為病毒原質(zhì)的組分,P5-1、P6和P9-1各自在病毒原質(zhì)和病毒復(fù)制中起著什么作用還沒有明確。RNAi技術(shù)是近年來研究基因功能的一個重要技術(shù)手段,利用RNAi技術(shù)進行植物病毒病的防治已成為重要的手段。因此,本研究擬利用RNAi技術(shù)鑒定SRBSDV在白背飛虱體內(nèi)復(fù)制起始的關(guān)鍵基因,為病毒病的防控提供一個高效靶標基因。本實驗首先擴增SRBSDV-P5-1N-端1-750 bp基因片段,通過Gateway體系構(gòu)建原核表達載體,特異性誘導(dǎo)表達目的蛋白條帶后注射新西蘭大白兔制備多克隆抗體,Western blot和免疫熒光標記技術(shù)的檢測結(jié)果表明,本實驗所制備的多克隆抗體能特異性檢測SRBSDV侵染水稻和白背飛虱表達的P5-1蛋白,表明本實驗所制備P5-1多克隆抗體具有較好的特異性。以SRBSDV病毒原質(zhì)組分P5-1、P6和P9-1蛋白為研究對象,利用T7轉(zhuǎn)錄酶體外合成其雙鏈RNA (double-stand RNA, dsRNA),利用顯微注射法將濃度約為0.5 μg/μL的dsRNA導(dǎo)入飼毒2d的白背飛虱體內(nèi),同時以注射dsGFP的處理為對照。注射后6d用相關(guān)蛋白的熒光抗體進行免疫熒光標記,共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),分別干擾P5-1、P6和P9-1基因表達后,均能明顯抑制相關(guān)基因P5-1、P6、P9-1、P7-1和P10在白背飛虱體內(nèi)的表達,且病毒被限制在初侵染的中腸上皮細胞中,沒有發(fā)生擴散。抑制P5-1蛋白表達后,P6和P9-1蛋白仍可表達,但僅限于在初侵染細胞中表達,P7-1和P10蛋白表達受到明顯抑制,認為P5-1作為與病毒粒體裝配有關(guān)的蛋白,其調(diào)控著外殼蛋白和擴散相關(guān)蛋白的表達,從而阻礙了病毒在白背飛虱體內(nèi)的裝配和擴散。干擾P6蛋白的表達后,84%的昆蟲體內(nèi)檢測不到P6蛋白,同時也檢測不到P5-1、P9-1、P7-1和P10蛋白,但在16%的昆蟲上皮細胞內(nèi)可檢測到P6蛋白,此時也可檢測到P5-1、P9-1、P7-1和P10蛋白,表明P6蛋白不表達則不能啟動病毒的增殖,一旦P6蛋白有少量的表達則啟動病毒在上皮細胞內(nèi)的增殖。抑制P9-1蛋白的表達后,P6蛋白仍可表達,但也僅局限在初侵染的上皮細胞內(nèi),而P5-1蛋白的表達受到抑制,同時P7-1和P10蛋白的表達也受到明顯抑制,表明參與病毒基因組復(fù)制的P9-1蛋白表達受抑制后,參與病毒裝配的P5-1蛋白和外殼蛋白P10的表達受到抑制,同時由于病毒無法裝配,使管狀結(jié)構(gòu)蛋白P7-1表達受到抑制。此外,本實驗通過RT-qPCR檢測了dsRNA對病毒增殖的影響,發(fā)現(xiàn)干擾P5-1、P6和P9-1基因的表達后,編碼病毒外殼蛋白的P10基因拷貝數(shù)相對處理組明顯下降,表明病毒在白背飛虱體內(nèi)的復(fù)制和增殖受到阻礙。Western blot檢測也發(fā)現(xiàn)分別抑制P5-1、P6和P9-1蛋白的表達后,能明顯抑制其它相關(guān)蛋白的表達。其中抑制P5-1蛋白表達后,能檢測P6和P9-1蛋白能有少量表達,P10幾乎沒有表達,干擾P6表達后,均沒有檢測到相關(guān)蛋白的表達；抑制P9-1蛋白表達后,P6蛋白有少量表達,其余相關(guān)蛋白均沒有檢測到。綜上所述,本研究通過dsRNA誘導(dǎo)的RNAi技術(shù),明確了P5-1、P6和P9-1均是SRBSDV在昆蟲體內(nèi)增殖的重要蛋白,抑制單個基因的表達均能明顯抑制病毒在介體昆蟲體內(nèi)的復(fù)制和擴散。P6蛋白在病毒增殖中起最關(guān)鍵的作用,負責(zé)啟動病毒在初侵染上皮細胞內(nèi)的增殖,抑制P6蛋白的表達則抑制病毒所有蛋白的表達；P9-1蛋白作為病毒基因組復(fù)制的場所,其表達受抑制后則間接調(diào)控與病毒裝配有關(guān)蛋白的不表達：P5-1蛋白作為病毒裝配的場所,抑制其表達則調(diào)控病毒外殼蛋白及管狀結(jié)構(gòu)蛋白P7-1的表達。因此,我們認為P6蛋白是病毒增殖過程中最關(guān)鍵的因子,對病毒原質(zhì)的形成發(fā)揮啟動作用,可作為病毒病防控的理想靶標蛋白。
【學(xué)位單位】：福建農(nóng)林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：S433
【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 引言
    1.1 南方水稻黑條矮縮病毒的研究進展
        1.1.1 南方水稻黑條矮縮病的發(fā)現(xiàn)、分布以及危害
        1.1.2 南方水稻黑條矮縮病的表型癥狀特點
        1.1.3 南方水稻黑條矮縮病的自然寄主和傳播介體
        1.1.4 SRBSDV的病毒學(xué)分類地位
        1.1.5 SRBSDV的基因組結(jié)構(gòu)及其功能研究
    1.2 植物呼腸孤病毒復(fù)制場所—病毒原質(zhì)的研究進展
    1.3 植物病毒在介體昆蟲體內(nèi)的侵染循回過程
    1.4 原核表達系統(tǒng)的研究概況以及應(yīng)用
    1.5 RNAi的發(fā)現(xiàn)以及應(yīng)用
        1.5.1 RNAi的發(fā)現(xiàn)
        1.5.2 RNAi的原理
        1.5.3 RNAi技術(shù)應(yīng)用
    1.6 本研究的目的和意義
2 實驗材料和方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 菌株和載體
        2.1.2 水稻病株和介體昆蟲白背飛虱
        2.1.3 實驗試劑
        2.1.4 實驗主要器材
    2.2 實驗方法
        2.2.1 SRBSDV蛋白P5-1抗體的制備
            2.2.1.1 引物的設(shè)計和合成
            2.2.1.2 感染SRBSDV的水稻總RNA提取
            2.2.1.3 RT-PCR擴增SRBSDV的基因片段P5-1
            2.2.1.4 純化回收擴增的SRBSDVP5-1產(chǎn)物
            2.2.1.5 入門載體pDONR221-P5-1的構(gòu)建
            2.2.1.6 原核表達載體pDEST17-P5-1的構(gòu)建
            2.2.1.7 原核表達載體pDEST17-P5-1轉(zhuǎn)入Rosetta（DE3）菌株
            2.2.1.8 SRBSDV非結(jié)構(gòu)蛋白P5-1的原核誘導(dǎo)表達
            2.2.1.9 SRBSDV非結(jié)構(gòu)蛋白P5-1抗血清的制備
            2.2.1.10 P5-1抗血清的特異性檢測
            2.2.1.11 P5-1抗血清的純化
            2.2.1.12 抗體交聯(lián)熒光素
            2.2.1.13 P5-1在SRBSDV侵染的白背飛虱體內(nèi)的分布
        2.2.2 源于SRBSDV基因片段的dsRNAs對病毒侵染白背飛虱的影響
            2.2.2.1 dsRNA的引物設(shè)計和合成
            2.2.2.2 微針注射體外合成的dsRNA
            2.2.2.3 免疫熒光標記檢測dsRNAs處理對SRBSDV在白背飛虱體內(nèi)侵染的影響
            2.2.2.4 RT-qPCR檢測體dsRNAs處理對SRBSDV侵染白背飛虱的影響
            2.2.2.5 Western blot檢測dsRNAs處理后SRBSDV編碼的相關(guān)蛋白在白背飛虱體內(nèi)表達量的變化
3 結(jié)果分析
    3.1 SRBSDV非結(jié)構(gòu)蛋白P5-1抗體的制備
        3.1.1 RT-PCR擴增目的片段
        3.1.2 入門載體pDONR221-P5-1的構(gòu)建
        3.1.3 原核表達載體pDEST17-P5-1的構(gòu)建
        3.1.4 原核表達載體pDEST17-P5-1轉(zhuǎn)入Rosetta（DE3）菌株
        3.1.5 SRBSDV非結(jié)構(gòu)蛋白P5-1的原核誘導(dǎo)表達
        3.1.6 Western blot檢測抗血清的特異性
        3.1.7 P5-1在SRBSDV侵染的白背飛虱體內(nèi)的分布
    3.2 dsRNAs處理對SRBSDV侵染白背飛虱的影響
        3.2.1 dsRNA的合成
        3.2.2 dsP5-1處理對病毒相關(guān)基因在白背飛虱體內(nèi)的表達的影響
        3.2.3 dsP6處理對病毒相關(guān)基因在白背飛虱體內(nèi)的表達的影響
        3.2.4 dsP9-1處理對病毒相關(guān)基因在白背飛虱體內(nèi)的表達的影響
    3.3 干擾單個基因表達明顯抑制病毒在白背飛虱體內(nèi)的復(fù)制
    3.4 dsRNA處理抑制SRBSDV相關(guān)基因在蛋白水平上的表達
4 討論
參考文獻
附錄
致謝

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