精子載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)操作簡(jiǎn)單,成本低廉,自Lvaitran 1989年提出以來(lái)受到了人們的廣泛關(guān)注。但是由于精子載體法精子存在在體外與外源DNA共孵育使精子活力下降影響與卵細(xì)胞結(jié)合使受精困難、外源DNA無(wú)法整合到動(dòng)物細(xì)胞基因組等缺陷,很大程度上限制了精子載體技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用。CRISPR/Cas9系統(tǒng)目前已經(jīng)在眾多研究人員實(shí)驗(yàn)結(jié)果中表現(xiàn)出強(qiáng)大的定點(diǎn)基因編輯能力,這一特點(diǎn)和精子載體法相結(jié)合制備基因編輯(基因突變)的遺傳修飾的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物具有一定的可行性。探討將兩個(gè)技術(shù)結(jié)合制備基因編輯雞在目前轉(zhuǎn)基因雞制備技術(shù)尚不成熟的情況下,具有重要的意義。因此,本試驗(yàn)旨在通過(guò)以雞生長(zhǎng)激素受體基因(Growth hormone receptor,GHR)為模型,篩選出高效的sgRNA,建立精子載體脂質(zhì)體孵育條件,將CRISPR/Cas9系統(tǒng)與精子載體技術(shù)結(jié)合,期望建立簡(jiǎn)單高效廉價(jià)的制備遺傳修飾雞的方法。主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下:高活性sgRNA體外酶切篩選:實(shí)驗(yàn)首先根據(jù)矮小型雞生長(zhǎng)激素受體基因缺失部分的外顯子區(qū)用在線sgRNA設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)5對(duì)sgRNA序列,并且分別構(gòu)建出前邊插入了 T7啟動(dòng)子的sgRNA的體外轉(zhuǎn)錄載體pT7-sgRNA-trac,轉(zhuǎn)錄出對(duì)應(yīng)的sgRNA。按照Cas9體外酶切試劑盒說(shuō)明書(shū)將Cas9蛋白、sgRNA和體外切割底物按比例混合孵育,酶切結(jié)果用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),結(jié)果:sgRNA1體外切割效率為82.1%,sgRNA2體外切割效率為57.4%,sgRNA3體外切割效率為92.5%,sgRNA4體外切割效率為33.7%,sgRNA5體外切割效率為95.4%。sgRNA活性的DF-1細(xì)胞內(nèi)鑒定及sgRNA脫靶分析:選擇靶向GHR基因體外酶切效率較高的sgRNA1、sgRNA3、sgRNA5,構(gòu)建出相應(yīng)的sgRNA、Cas9蛋白和EGFP共表達(dá)載體。構(gòu)建左右同源臂質(zhì)粒載體pMD19T-zyb,將Neo R表達(dá)結(jié)構(gòu)和左右同源臂連接構(gòu)建打靶載體pMD19T-Neo-zyb。將sgRNA、Cas9蛋白和EGFP共表達(dá)載體分別和打靶載體共轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞,用G418篩選,挑單克隆細(xì)胞并且增殖培養(yǎng),將所有陽(yáng)性單克隆細(xì)胞基因組DNA通過(guò)PCR擴(kuò)增鑒定NeoR定點(diǎn)插入,并且將鑒定未定點(diǎn)插入的單克隆細(xì)胞基因組通過(guò)PCR擴(kuò)增GHR基因檢測(cè)靶點(diǎn)處基因序列并進(jìn)行測(cè)序鑒定靶位點(diǎn)處是否發(fā)生編輯,其中sgRNA1獲得16株細(xì)胞克隆有2株為定點(diǎn)插入陽(yáng)性,編輯效率為12.5%;sgRNA3獲得23株細(xì)胞克隆有9株為定點(diǎn)插入陽(yáng)性,2株為未定點(diǎn)插入但靶點(diǎn)序列發(fā)生突變,編輯效率為47.8%;sgRNA5獲得24株細(xì)胞克隆有11株為定點(diǎn)插入陽(yáng)性,2株為未定點(diǎn)插入但靶點(diǎn)序列發(fā)生突變,編輯效率為54.2%。根據(jù)在線脫靶分析軟件設(shè)計(jì)對(duì)sgRNA1、sgRNA3、sgRNA5分別選出5個(gè)潛在脫靶位點(diǎn),并設(shè)計(jì)相應(yīng)引物,以篩選到的所有Neo R抗性為陽(yáng)性的細(xì)胞克隆基因組為模板PCR擴(kuò)增出對(duì)應(yīng)潛在脫靶位點(diǎn)序列并測(cè)序:分別選出的5個(gè)潛在脫靶位點(diǎn)均未檢測(cè)到sgRNA發(fā)生脫靶。精子孵育條件建立:采集新鮮公雞精液,取200μL精液,洗滌液同孵育液洗滌精清,孵育液分別為稀釋液、DMEM培養(yǎng)基、1640培養(yǎng)基、PBS緩沖液,孵育時(shí)間分別為10min、30min、60min、90min,觀察精子活力選擇合適的孵育液,選擇能維持精子較高活力的孵育液分別與pX330質(zhì)粒共孵育10min、30min、60min、90min,觀察精子活力并且以半定量PCR鑒定攝取外源DNA情況篩選出最優(yōu)孵育時(shí)間;另一組試驗(yàn)為孵育前分別用0μL、1μL、1.5 μL、2 μL脂質(zhì)體包被質(zhì)粒DNA,孵浴時(shí)間60 min,半定量PCR鑒定攝取外源DNA情況及有活力的精子所占比例綜合選擇合適的脂質(zhì)體體積;通過(guò)人工授精,比較不同孵育方法受精率,并PCR鑒定攜帶外源DNA的受精蛋胚盤(pán)數(shù)以確定最佳孵育方法。結(jié)果不同孵育液孵育后,M199培養(yǎng)液做為孵育液孵育后有活力的精子所占比例顯著高于其他組(P0.05),孵育時(shí)間60 min時(shí)為最佳孵育時(shí)間;脂質(zhì)體孵育最佳的脂質(zhì)體用量為1.5μL;普通孵育處理的受精率為51.18%,脂質(zhì)體孵育處理的受精率為44.78%,差異不顯著(P0.05),簡(jiǎn)單孵育外源DNA 陽(yáng)性率為14.94%,脂質(zhì)體孵育外源DNA 陽(yáng)性率28.89%,差異顯著(P0.05)。編輯胚胎或個(gè)體的鑒定:將DF-1細(xì)胞篩選高效的sgRNA、Cas9蛋白、EGFP共表達(dá)載體與精子在建立的合適孵育條件下脂質(zhì)體共孵育,人工授精,第X期胚盤(pán)水平和剛出殼雛雞組織水平檢測(cè)基因編輯:第X期胚盤(pán)1087枚,鑒定出3枚受精蛋發(fā)生基因編輯,初步估計(jì)編輯效率為0.28%,發(fā)生基因編輯的3枚受精蛋中發(fā)生基因編輯細(xì)胞數(shù)分別占第X期總細(xì)胞數(shù)的比例初步估計(jì)為10.4%、12.5%、10.4%,經(jīng)雞胚基因組DNA進(jìn)行PCR鑒定性別,發(fā)生基因編輯的3枚受精蛋均為雌性,推測(cè)CRISPR/Cas9系統(tǒng)發(fā)生基因編輯的時(shí)期在受精卵發(fā)育到8細(xì)胞期之前;雛雞組織未鑒定出發(fā)生基因編輯的樣品,導(dǎo)致的原因可能是多樣的。本試驗(yàn)通過(guò)將篩選靶向GHR基因的高效sgRNA,建立適合雞精子載體的孵育條件,將兩者相結(jié)合,在第X期胚盤(pán)中實(shí)現(xiàn)了定點(diǎn)基因編輯,為矮小雞制備建立了一個(gè)新的技術(shù)方法,同時(shí)也為其他基因編輯及甚至基因打靶的轉(zhuǎn)基因雞的制備提供了新的思路和方法。
【學(xué)位單位】：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2020
【中圖分類】：S831
【部分圖文】：

ＮＡ的識(shí)別切割目前使用最廣泛的就??由ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系統(tǒng)改造而來(lái)ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系統(tǒng)，通過(guò)人工設(shè)計(jì)ｓｇＲＮＡ，引導(dǎo)Ｃａｓ９蛋白對(duì)特??異序列識(shí)別并切割，造成ＤＮＡ雙鏈斷裂（ｄｏｕｂｌｅ?ｓｔｒａｎｄ?ｂｒｅａｋ，?ＤＳＢ）。ＤＳＢ就會(huì)促使細(xì)胞啟動(dòng)??ＤＮＡ損傷修復(fù)機(jī)制：非同源末端連接（ｎｏｎ－ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ?ｅｎｄ?ｊｏｉｎｉｎｇ，?ＮＨＥＪ）［５９１和同源重組修復(fù)??（ｈｏｍｏｌｏｇｙ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ?ｒｅｐａｉｒ，?ＨＤＲ）＿，從而實(shí)現(xiàn)基因序列的插入、缺失、替換，見(jiàn)圖１－１。對(duì)于??ＳｇＲＮＡ，?ＲＮＡ聚合酶ＩＩＩ識(shí)別的Ｕ６或Ｈ１啟動(dòng)子在啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄時(shí)依賴的聚合酶在ＲＮＡ的５＇端需??要Ｇ或ＧＧ，所以目前研宄者常在設(shè)計(jì)ｓｇＲＮＡ的５＇端無(wú)Ｇ或ＧＧ時(shí)，合成引物時(shí)在ｓｇＲＮＡ的??５＇端加Ｇ或ＧＧ，既可以合成有活性的ｓｇＲＮＡ，又可以提高Ｃａｓ９核酸酶編輯的效率［６｜１。２０１３??年，科學(xué)家在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了對(duì)特定基因的編輯Ｍ，從此這項(xiàng)技術(shù)得到了迅速發(fā)展，推??動(dòng)了生命科學(xué)多個(gè)領(lǐng)域的跨越式發(fā)展。??纖?ｆｃＷ＂乂Ｖ?，；??ｉｉ?ｌｉｔｉｉｉｉｉｉｎｎｉｉｉｒ??５?ｉｎｎＴｆｎＴｎＴＴＴｎＴｎ＾ｊ?丨１１??ＯＶＷＴＪＫ?ＤＭＡ?Ｘ?＇?＾??．細(xì)＜??ｌ??ｒ?ｉｌｌｌｌｉｌｉｌ??１??ｈｕｂｓ??ＢＢＢＳＥｌｌｉｌＳＩ?—，?ＢＥＳＳｐｉｐｉｌｌ??ｍＢＥ?１！?ｉｌｌｌｌｉ?＿工麵??ＭＥＩＨｌｌ：?ＳＨＩ??圖１－１?ＣＰＩＳＲＰ／Ｃａｓ９工作原理??ＦＩＧ．?１－１?Ｈｏｗ?ＣＰＩＳＲＰ／Ｃａｓ９?ｗｏｒｋｓ??１．３．２?ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９?的應(yīng)用??隨著Ｃ

?河北農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位（畢業(yè)）論文???２材料方法??２．１儀器材料與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物??２．１．１質(zhì)粒與引物合成??ｐＸ３３０、ｐＥＧＦＰ－Ｎ２?質(zhì)粒購(gòu)買(mǎi)自美國(guó)?ａｄｄｇｅｎｅ?公司，ｐＭＤ１９－Ｔ?ｖｅｃｔｏｒ?和?ｐＭＤ１９?－Ｔ?ｓｉｍｐｌｅ?ｖｅｃｔｏｒ??載體購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司，ｐＴ７－５ｔｅ／－ｔｒａｃ質(zhì)粒（圖２－１－ａ?）、ｐＣＭＶ－ＮｅｏＲ－ｂｇｈ??質(zhì)粒（圖２－１－ｂ?）由本實(shí)驗(yàn)室改造，引物合成、基因測(cè)序均由深圳華大基因科技有限公司完成。??掛《ｓ?丨，Ｂｂｓｉ??〇?Ｉ?Ｊ??ａ?ｂ??圖２－１質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖??ＦＩＧ．?２－１?Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?ｐｌａｓｍｉｄ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ??注：ａ：?ｐＴ７－＾Ｚｗ／－ｔｒａｃ質(zhì)粒載體結(jié)構(gòu)示意圖；ｂ：?ｐＣＭＶ－ＮｅｏＲ－ｂｇｈ質(zhì)粒載體結(jié)構(gòu)示意圖??Ｎｏｔｅ：?ａ：?ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?ｐｌａｓｍｉｄ?ｃａｒｒｉｅｒ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ?ｏｆ?ｐｔ７－ｂｂｓｉ－ｔｒａｃ；Ｂ：?ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?ｐｌａｓｍｉｄ?ｃａｒｒｉｅｒ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ?ｏｆ?ｐｃｍｖ－ｎｅｏｒ－ｂｇｈ??２．１．２實(shí)驗(yàn)試劑及來(lái)源??ｄＮＴＰｓ?（２．５ｍ?Ｍｅａｃｈ）、Ｔａｑ?酶、６ＸＤＮＡ?ｌｏａｄｉｎｇ?Ｂｕｆｆｅｒ、Ｅ．ｃｏｌｉ?ＤＨ５ａ感受態(tài)細(xì)胞、組織?ＤＭＡ??提取試劑盒均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；瓊脂糖，甘油，胰蛋白胨，瓊脂粉，酵母提取??粉，氯化鈉，無(wú)水乙醇，異丙醇均購(gòu)自保定賽爾克公司；質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北??京）有限公司；胎牛血清、ＤＭＥＭ培養(yǎng)液、Ｍ１９９培

５０°〇水�。保担保保必保�，轉(zhuǎn)化入￡．〇〇１丨０１１５〇１感受態(tài)細(xì)胞，搖菌５〇１１１１＾，提取質(zhì)粒，方法參考質(zhì)粒??提取試劑盒：將菌液在超凈臺(tái)中轉(zhuǎn)移到不同的５?ｍＬ無(wú)菌離心管中，１２０００?ｒｍｐ離心１?ｍｉｎ，盡量??吸凈上清培養(yǎng)液。加入２５０?ｐＬ溶液Ｉ?（預(yù)加ＲＮａｓｅＡ），用渦旋震蕩機(jī)充分渦旋震蕩使細(xì)菌細(xì)胞??重懸。向離心管中加入２５０吣溶液ＩＩ，輕輕上下顛倒幾次，使菌液充分裂解，此時(shí)混合液由渾??濁變的清澈。加入３５０吣溶液ＩＩＩ，立即上下顛倒充分混勻，出現(xiàn)白色沉淀，１２０００?ｒｍｐ離心１０?ｍｉｎ。??將上清液移入到吸附柱中，室溫放置２?ｍｉｎ，?１２０００?ｒｐｍ離心１?ｍｉｎ。倒掉收集管中的廢液，吸附??柱重新放回收集管中，向吸附柱中加入７００?ｐＬ漂洗液（預(yù)加無(wú)水乙醇）１２０００?ｒｐｍ離心１?ｍｉｎ，??倒掉收集管中的廢液，１２０００?ｒｐｍ空離心３?ｍｉｎ，室溫開(kāi)口在放置３?ｍｉｎ，使漂洗液去除。吸附柱??放入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜中央加入４０ｐＬ預(yù)熱至６０°Ｃ的ｄｄＨ２０，室溫靜置５ｍｉｎ。??１２０００?ｒｐｍ離心１?ｍｉｎ，收集質(zhì)粒溶液，做上標(biāo)記，－２０°Ｃ保存。后續(xù)質(zhì)粒提取實(shí)驗(yàn)操作相同，質(zhì)??粒命名為ＰＸ３３０－ＥＧＦＰ，其結(jié)構(gòu)功能見(jiàn)圖２－２。??
【參考文獻(xiàn)】

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