【摘要】：大豆霜霉病是由專性寄生菌Peronospora manhurica(Naoun.)Sydow引起的真菌病害,嚴(yán)重威脅大豆生產(chǎn),在世界各大豆產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生,在我國(guó)東北和華北地區(qū)的發(fā)生尤其普遍,嚴(yán)重年份可減產(chǎn)30%～50%。本實(shí)驗(yàn)室在前期研究中發(fā)現(xiàn),大豆絲氨酸/丙氨酸-乙醛酸轉(zhuǎn)氨酶(GmS4GT1)基因的表達(dá)與大豆霜霉病抗性密切相關(guān),高抗品種中GmS4GT1的平均表達(dá)量是高感品種的13倍,GmSAGT1在轉(zhuǎn)錄水平上參與大豆霜霉病抗性,抗、感品種中GmSAGT1的編碼基因、酶學(xué)功能和啟動(dòng)子均差異微小。GmS4GT1啟動(dòng)子序列分析發(fā)現(xiàn)有2個(gè)轉(zhuǎn)錄因子WRKY的Binding site。已知WRKY是植物的重要轉(zhuǎn)錄因子,在多種植物的抗逆、抗病等生物過(guò)程起重要作用。迄今為止,WRKY轉(zhuǎn)錄因子與大豆霜霉病抗性相關(guān)性的研究尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。為此,本論文對(duì)大豆霜霉病抗病相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子WRKY進(jìn)行了篩選和研究,主要成果如下:1.以高抗和高感霜霉病的大豆品種為材料,分別提取接種和未接種霜霉病菌的大豆葉片RNA,進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,分析接種前后WRKYs的表達(dá)量,發(fā)現(xiàn)7個(gè)WRKYs(WRKY5,WRKYY56,WRKY81,WRKY106,WRKY109,WRKY139 和 WRKY161)差異表達(dá)。接種后這7個(gè)基因在抗病品種中的表達(dá)量均高于感病品種,推測(cè)參與調(diào)控GwSA4GT1基因的表達(dá)和大豆霜霉病抗性。2.利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù),對(duì)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證發(fā)現(xiàn),7個(gè)WRKYs基因在抗感病品種中的表達(dá)趨勢(shì)與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果一致,證明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序研究結(jié)果可靠。3.為利用植物體內(nèi)瞬時(shí)表達(dá)技術(shù)鑒定GwSAGT1啟動(dòng)子的活性,分別構(gòu)建3個(gè)植物表達(dá)載體:1)以958bpGwSAGT1全長(zhǎng)啟動(dòng)子G958,驅(qū)動(dòng)GFP表達(dá)的植物表達(dá)載體pG958∷GFP;2)以GmS4GT1啟動(dòng)子3'端355bp核心區(qū)的G355驅(qū)動(dòng)GFP表達(dá)的植物表達(dá)載體pG355∷GFP;3)以GmS4GT1啟動(dòng)子3'端181bp核心區(qū)G181驅(qū)動(dòng)GFP表達(dá)的植物表達(dá)載體pG181∷GFP,轉(zhuǎn)入擬南芥原生質(zhì)體中,利用共聚焦激光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),G958∷GFP、G355::GFP和G181∷GFP在擬南芥原生質(zhì)體細(xì)胞中均有綠色熒光表達(dá),G958∷GFP的表達(dá)最強(qiáng),G355∷GFP和G181∷GFP的擬南芥原生質(zhì)體細(xì)胞中的綠色熒光的亮度相當(dāng)。表明3種啟動(dòng)子均具有啟動(dòng)基因表達(dá)的能力,可以用于酵母單雜交研究中誘餌載體的構(gòu)建。4.利用酵母單雜交實(shí)驗(yàn),對(duì)7個(gè)WRKYs基因進(jìn)行篩選,發(fā)現(xiàn)WRKY5,WRKYY56,WRKY106,WRKY109,WRKY1 39和WRKY161均不能與GmSAGT1轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-235處和-272處的兩個(gè)WRKY Bingding site(W-box)互作,WRKY81既能與GmSAGT1轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的W-boxl(TGACGTAC)結(jié)合也能與W-box2(GACTGAC)結(jié)合,表明WRKY81能夠在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控GmSAGT1的表達(dá),并參與大豆對(duì)霜霉病的抗性調(diào)控。本論文首次發(fā)現(xiàn)WRKY在大豆高抗高感中差異表達(dá),與大豆對(duì)霜霉病的抗性密切相關(guān),WRKY81通過(guò)與GmS4G71啟動(dòng)子上2個(gè)W-box的結(jié)合,調(diào)控大豆的霜霉病抗性。推測(cè)大豆受到病原菌刺激后WRKY81表達(dá)量首先上調(diào),通過(guò)與GmS4GT1啟動(dòng)子結(jié)合,激活GmSAGT1基因表達(dá),從而提高寄主植物葉片中活性氧含量,誘導(dǎo)超敏反應(yīng)的發(fā)生,提高大豆對(duì)霜霉病的抗性。植物抗病反應(yīng)是一個(gè)極其復(fù)雜的反應(yīng),它涉及多個(gè)網(wǎng)絡(luò)和多種機(jī)理,本研究對(duì)揭示大豆霜霉病抗性的分子機(jī)理提供了一個(gè)良好的開(kāi)端,具有重要意義。
【學(xué)位授予單位】：沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S435.651

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本文編號(hào)：2538549