【摘要】：油菜是我國(guó)重要的油料作物之一。進(jìn)一步提高油酸含量適當(dāng)降低亞麻酸含量是油菜品質(zhì)改良的重要內(nèi)容,而獲得高油酸和低亞麻酸資源是開展育種工作的基礎(chǔ)。本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù),對(duì)控制油菜種子中油酸含量的FAD2及亞麻酸含量的FAD3基因進(jìn)行定點(diǎn)編輯,并通過對(duì)轉(zhuǎn)基因后代的連續(xù)自交和回交,獲得了不帶有轉(zhuǎn)基因元件的高油酸低亞麻酸突變體。主要研究結(jié)果如下:1.對(duì)甘藍(lán)型油菜FAD2與FAD3基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析,使用在線軟件篩選出基因編輯靶點(diǎn),構(gòu)建了對(duì)油菜FAD2與FAD3基因靶點(diǎn)特異的CRISPR/Cas9植物表達(dá)載體。以農(nóng)桿菌介導(dǎo)的下胚軸轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化油菜品系J9707,獲得了143株轉(zhuǎn)FAD2靶基因和169株轉(zhuǎn)FAD3靶基因轉(zhuǎn)基因油菜。2.通過非變性PAGE膠檢測(cè)了所有的轉(zhuǎn)基因陽性植株,并挑選出部分突變單株進(jìn)行了測(cè)序分析。本研究對(duì)FAD2靶基因的編輯效率為16%,而對(duì)FAD3的編輯效率為5%。FAD2突變體測(cè)序與靶基因核酸序列比對(duì)表明,單個(gè)堿基插入是主要的突變類型,占到各種突變類型的50%以上,同時(shí)還發(fā)現(xiàn)有2個(gè)至13個(gè)堿基缺失的多種突變類型。部分FAD3突變體測(cè)序結(jié)果檢測(cè)到G-A堿基的替換和2個(gè)堿基AC的插入的突變。3.對(duì)FAD2基因在2個(gè)靶點(diǎn)各個(gè)拷貝突變效率進(jìn)行了比較分析。針對(duì)第一個(gè)靶位點(diǎn),BnaA.FAD2.a與BnaC.FAD2.a拷貝的突變效率為分別為53%和29%;而BnaA.FAD2.b與BnaC.FAD2.b拷貝雖然只在靶標(biāo)序列的第一個(gè)堿基處有差異,前者的突變率為18%,BnaC.FAD2.b拷貝未檢測(cè)到突變。統(tǒng)計(jì)結(jié)果還發(fā)現(xiàn)PAM序列對(duì)突變效率有較大影響。在第二個(gè)靶點(diǎn)位置,BnaA.FAD2.a拷貝的PAM序列為-GGG,突變效率為71%,然而PAM序列為-NGA的其他拷貝均未出現(xiàn)突變。4.突變單株自交及雜交后代基因型分析表明,雜合突變單株后代基因型的分離比符合孟德爾遺傳規(guī)律。本研究在T0代沒有編輯的陽性單株后代株系中檢測(cè)到了突變單株,也觀測(cè)到有些在T0代葉片中檢測(cè)到突變不存在于種子的后代中;通過回交和自交能有效清除轉(zhuǎn)化植株中的轉(zhuǎn)基因成分。5.分析了轉(zhuǎn)FAD2靶基因的突變單株在T1、T2和T3代種子各種脂肪酸含量。突變體種子中油酸含量顯著提高,最高超過80%(野生型平均為66.43%),而亞麻酸含量顯著下降。突變體中葉片的油酸含量與種子中油酸含量有顯著的正相關(guān)。轉(zhuǎn)FAD3靶基因的突變單株在T2代種子中亞麻酸含量顯著下降。
【圖文】：

利用基因組編輯技術(shù)創(chuàng)造油菜脂肪酸變異新資源在后期要經(jīng)過大量的篩選工作，并且編輯效率沒有明顯的提高（Terada et al 2002）。因此，傳統(tǒng)的基因組編輯技術(shù)需要大量的人力與物力并且存在一定的安全問題不被人類普遍接受。近年來發(fā)展的人工核酸酶介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)則不同，這種技術(shù)理論上能夠切除任何物種基因組的任何位置，從而能在內(nèi)源性序列上引入特異性修飾。該技術(shù)與傳統(tǒng)的基因組編輯技術(shù)最大的區(qū)別是能夠?qū)?T-DNA 從轉(zhuǎn)基因受體中分離出來，得到不含轉(zhuǎn)基因成分的突變體（Bassett et al 2013，Zhang et al 2014，Bassett et al 2015）。

CRISPR/Cas9 系統(tǒng)介導(dǎo)植物定點(diǎn)突變無論是單位點(diǎn)編輯、多位點(diǎn)的刪除及置換都具有高效性和特異性，并且載體構(gòu)建簡(jiǎn)便靈活。在農(nóng)，利用 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)能夠快速實(shí)現(xiàn)基因定點(diǎn)突變和聚合某些優(yōu)良育種提供更有效的方法。油菜脂肪酸改良及脂肪酸相關(guān)基因的研究進(jìn)展油菜是不僅是我國(guó)重要的食用油和高蛋白飼料源，同時(shí)也是氫化油最理油菜的脂肪酸改良也主要是從不同的用途展開，，其中最受關(guān)注的一方籽油具有很好的熱穩(wěn)定性，在加熱及存儲(chǔ)過程中不易氧化，可以用來，清潔環(huán)保。油酸還能有效預(yù)防一些動(dòng)脈硬化等疾病的發(fā)生，對(duì)人類要的作用（官春云 2006）。另外，菜籽油中的α-亞麻酸容易發(fā)生氧化產(chǎn)物會(huì)使油脂腐敗變質(zhì)并對(duì)人體健康產(chǎn)生不利影響（張正麗 2013）。肪酸改良與形成等相關(guān)機(jī)理成為了油菜的研究熱點(diǎn)。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S565.4

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2538225